?；撬釋?duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制初步研究.pdf

1、現(xiàn)如今，腫瘤是危害人類(lèi)健康最嚴(yán)重的疾病之一。在我國(guó)，近年來(lái)惡性腫瘤已成為死因譜中第一位的死亡原因，嚴(yán)重危害人們的健康和生命。因此，腫瘤的預(yù)防和控制已經(jīng)成為當(dāng)前最重要的衛(wèi)生工作之一。研究表明，人類(lèi)約有40％～60％的腫瘤是由化學(xué)因素引起的，而化學(xué)因素又主要與飲食有關(guān)。因此，對(duì)腫瘤的膳食預(yù)防是一項(xiàng)積極的防癌策略。近幾年，膳食中的抗癌、防癌物質(zhì)已經(jīng)成為腫瘤化學(xué)預(yù)防的研究熱點(diǎn)。?；撬?Taurine，Tau)是具有簡(jiǎn)單化學(xué)結(jié)構(gòu)的含硫氨基酸。人體

2、內(nèi)Tau的含量較高，約占人體體重的0.1％，幾乎全部以游離形式存在于所有臟器中。大量的國(guó)內(nèi)外研究及臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，Tau具有廣泛的生理功效，是機(jī)體內(nèi)源性抗損傷物質(zhì)，但是關(guān)于Tau抗腫瘤作用方面的研究較少，作用機(jī)制也尚未明確。
　　 目的：
　　 觀察Tau對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 檢測(cè)Tau對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)采用4株腫瘤細(xì)胞和1株人正常細(xì)胞，分別是人乳腺癌細(xì)

3、胞MCF-7(p53野生型，p53+/+)和MDA-MB-231(p53突變型，p53-/-)、人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo(p53+/+)和HT-29(p53-/-)以及人胚腎細(xì)胞293T。用不同濃度(0mM、10 mM、20 mM、40 mM、80 mM、160 mM)的Tau分別處理4株腫瘤細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞一定時(shí)間后，MTT檢測(cè)其細(xì)胞活性的改變；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率的改變；應(yīng)用Hoechst33342核染法觀察腫瘤細(xì)胞凋亡的形

4、態(tài)學(xué)改變；RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)PUMA及凋亡相關(guān)基因BAX、Bcl-2的mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化；分光光度法檢測(cè)MDA-MB-231的Caspase-3活性變化。
　　 應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將PUMA特異性siRNA(PUMA-siRNA，si-PUMA)轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo，檢測(cè)PUMA沉默后對(duì)Fau誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。用lipofectamine2000(lipo2000)包裹不同濃度的

5、帶有熒光標(biāo)記的FAM-siRNA(si-FAM)轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。在篩選si-PUMA片段的實(shí)驗(yàn)中，將實(shí)驗(yàn)分為6組：①Control組，②siRNA片段Ⅰ，③siRNA片段Ⅱ，④siRNA片段Ⅲ，⑤陽(yáng)性對(duì)照組(Positive Control，PC)，⑥陰性對(duì)照組(Negative Control，NC)，并轉(zhuǎn)染48h后，用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)各組PUMA表達(dá)情況，篩選出沉默效率較高的si-PU

6、MA片段。為檢測(cè)PUMA對(duì)Tau誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將si-PUMA轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為4組：①Control組，②NC組，③si-PUMA組，④si-PUMA+Tau80mM組。實(shí)驗(yàn)于48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LoVo的細(xì)胞凋亡率；Western blot方法檢測(cè)PUMA及凋亡相關(guān)基因BAX、Bcl-2蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 隨著Tau濃度和處理時(shí)間的增加，4株腫瘤細(xì)胞的增殖活

7、性均出現(xiàn)降低趨勢(shì)，Tau對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率出現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)。計(jì)算Tau作用48h后的IC50發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7(p53+/+)的IC50(133.61 mM)比MDA-MB-231(p53-/-)的IC50(127.21 mM)大1.05倍，人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo(p53+/+)的IC50(297.81mM)比HT-29(p53-/-)的IC50(45.66 mM)大4.76倍，提示Tau對(duì)p53-/-腫瘤細(xì)胞抑制作用更加明顯。

8、但Tau作用于正常人胚腎細(xì)胞293T24 h和48 h后，其細(xì)胞活性并無(wú)顯著性影響，只是在72 h后的較高濃度組對(duì)293T細(xì)胞出現(xiàn)輕微抑制，這就提示Tau對(duì)人正常細(xì)胞的增殖影響并不明顯。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Tau濃度的增加，兩組腫瘤細(xì)胞的凋亡率均逐漸升高，并且p53-/-細(xì)胞比p53+/+細(xì)胞的凋亡率增加更加明顯，這與MTT結(jié)果相似。Hoechst33342核染色發(fā)現(xiàn)，Tau80mM處理48 h后，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核均出現(xiàn)不同程度的致

9、密濃染或碎塊狀致密濃染的典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。RT-PCR圖像分析顯示：隨著Tau濃度的增加，兩組腫瘤細(xì)胞的促凋亡基因PUMA，BAX mRNA表達(dá)水平都出現(xiàn)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)。Western blot結(jié)果顯示：隨著Tau濃度的增加，兩組細(xì)胞中促凋亡蛋白PUMA和BAX水平出現(xiàn)明顯上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2水平明顯下調(diào)。Caspase-3活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Tau處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，Casp

10、ase-3活性顯著升高，Tau40 mM是Control組的(1.33±0.13)倍，Tau80mM是Control組的(3.25±0.16)倍，Tau160 mM是Control組的(4.39±0.24)倍。
　　 不同濃度的si-FAM轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)si-FAM濃度為100nM時(shí)轉(zhuǎn)染效率比較高，為61.34％。RT-PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)siRNA片段都不同程度的下調(diào)了PU

11、MA mRNA和PUMA蛋白的表達(dá)，其中siRNA片段Ⅱ下調(diào)PUMA表達(dá)效果最顯著。siRNA特異性干擾LoVo細(xì)胞PUMA基因表達(dá)后，si-PUMA組的早期凋亡率(5.16±0.19)％和晚期凋亡率(4.29±0.35)％較Control組早期凋亡率(9.39±0.32)％和晚期凋亡率(7.50±0.34)％相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。si-PUMA+Tau組的早期凋亡率(9.52±0.35)％和晚期凋亡率(9.

12、28±0.11)％與si-PUMA組相比均出現(xiàn)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而si-PUMA+Tau組早期凋亡率與Control相比沒(méi)有明顯差異，但是其晚期凋亡率較Control組(7.50±0.34)％相比出現(xiàn)升高。Westernblot結(jié)果顯示：特異性干擾LoVo細(xì)胞PUMA表達(dá)后，si-PUMA組的PUMA和BAX蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，與Control相比有顯著性差異。繼續(xù)用Tau80 mM處理，與si-

13、PUMA組相比，si-PUMA+Tau組PUMA和BAX蛋白表達(dá)出現(xiàn)輕度上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)出現(xiàn)輕度下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Tau具有抑制乳腺癌與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡的作用，從而達(dá)到一定程度防治腫瘤的效果，并且Tau對(duì)p53-/-腫瘤細(xì)胞比對(duì)p53+/+腫瘤細(xì)胞的抑制作用更加明顯。
　　 2、Tau的促凋亡作用可能通過(guò)上調(diào)PUMA表達(dá)，進(jìn)而引起B(yǎng)AX表達(dá)上調(diào)