γ-多聚谷氨酸對(duì)糖脂嫁接物膠束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的影響.pdf

1、殼聚糖-硬脂酸膠束（Chitosan-g-stearic acid，CS）具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞攝取能力和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)能力，其表面正電荷可有效密接質(zhì)粒DNA(Plasmid DNA,pDNA)，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)外基因有效轉(zhuǎn)染和抗腫瘤療效。前期研究結(jié)果表明，CS嫁接物膠束包封治療基因進(jìn)入靶細(xì)胞后，遞送系統(tǒng)的內(nèi)涵體快速逃逸和治療基因的有效釋放，是制約其基因轉(zhuǎn)染效率的主因。為實(shí)現(xiàn)遞送系統(tǒng)在靶細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體快速逃逸以及基因藥物的有效釋放，本研究構(gòu)建殼聚糖-硬

2、脂酸嫁接物/聚乙二醇化多聚谷氨酸/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)，考察聚乙二醇化多聚谷氨酸(Poly(ethyleneglycol)-b-poly(γ-glutamic acid)，PG）的引入對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響、研究其相應(yīng)的細(xì)胞攝取、內(nèi)涵體逃逸和pDNA釋放等過(guò)程的相關(guān)機(jī)理。
　　本研究以18.0 kDa的殼聚糖（Chitosan）為原料，以碳二亞胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiim

3、ide，EDC）為交聯(lián)耦合劑，通過(guò)CS側(cè)鏈上的氨基和硬脂酸（Stearic acid，SA）上的羧基酰胺反應(yīng)，合成CS。通過(guò)席夫反應(yīng)在CS上鍵合聚乙二醇(Poly(ethylene glycol)，PEG），合成聚乙二醇化的糖脂嫁接物（PEGylated chitosan-g-stearic acid, PCS）。核磁共振氫譜確證CS和PCS嫁接物的化學(xué)結(jié)構(gòu);三硝基苯磺酸法測(cè)定氨基取代度;芘熒光法測(cè)定臨界膠束濃度;動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定嫁接物

4、膠束的粒徑和表面電位;透射電鏡觀察膠束的大小和形態(tài)學(xué)特征。引入陰離子多肽PG，分別構(gòu)建CS/pDNA、PCS/pDNA二元和CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)。測(cè)定基因遞送系統(tǒng)的粒徑和表面電位，通過(guò)透射電鏡觀察其粒子大小和形態(tài);凝膠電泳分析嫁接物膠束對(duì)pDNA的密接能力，以及DNaseⅠ酶保護(hù)能力。以編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白pEGFP-C1為報(bào)告基因，以人胚腎細(xì)胞HEK293作為模型細(xì)胞，用熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，用FC定

5、量測(cè)定其轉(zhuǎn)染效率，比較二元、三元基因遞送系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率的差異;以食管癌細(xì)胞EC-1作為模型細(xì)胞，通過(guò)三種不同的復(fù)合方式分別制備CS/PG/pDNA-Ⅰ、CS/PG/pDNA-Ⅱ和CS/PG/pDNA-Ⅲ三元基因遞送系統(tǒng)，用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，用FC定量測(cè)定其轉(zhuǎn)染效率，比較和總結(jié)不同三元基因遞送系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率的差異和特點(diǎn)。MTT法考察遞送系統(tǒng)

6、及其對(duì)應(yīng)載體的細(xì)胞毒性。用四甲基異硫氰酸羅丹明B（Rhodamine B isothiocyanate，RITC）標(biāo)記的CS和PCS制備二元、三元基因遞送系統(tǒng)，CLSM觀察其細(xì)胞攝取、胞內(nèi)內(nèi)涵體逃逸和報(bào)告基因的細(xì)胞內(nèi)釋放過(guò)程。FC定量測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞百分率和平均熒光強(qiáng)度，考察基因遞送系統(tǒng)在HEK293和EC-1細(xì)胞上的攝取能力，以γ-多聚谷氨酸(Poly(γ-glutamic acid)，γ-PGA）為攝取抑制劑，研究基因遞送系統(tǒng)在HEK2

7、93細(xì)胞上的入胞途徑。以HEK293為模型細(xì)胞，CLSM共定位分析，研究基因遞送系統(tǒng)的內(nèi)涵體逃逸和報(bào)告基因的釋放動(dòng)力學(xué);以巨噬細(xì)胞RAW264.7作為模型細(xì)胞，CLSM觀察基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞攝取，考察PEG修飾對(duì)基因遞送系統(tǒng)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（Reticuloendothelial system，RES）吞噬的影響。經(jīng)EDC介導(dǎo)，得到兩親性CS嫁接物。核磁共振氫譜確證了CS和PCS的化學(xué)結(jié)構(gòu)，二者的氨基取代度分別為7.1％和11.0％，其相

8、應(yīng)的臨界膠束濃度分別為72.0和89.0μg/mL;濃度為1.0 mg/mL時(shí)，其表面電位分別為18.7±0.6和16.3±1.6 mV。TEM圖顯示膠束呈類球形，粒徑較小，分布均一。嫁接物膠束具有較強(qiáng)的pDNA密接能力，當(dāng)N/P比≥1時(shí)，CS完全阻滯pDNA遷移，CS/pDNA和PCS/pDNA二元、CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)均具備DNaseⅠ酶保護(hù)能力。體外基因轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，在HEK293細(xì)胞上，當(dāng)N/C/P比為2.5∶1

9、∶1時(shí)，CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)達(dá)到最大基因轉(zhuǎn)染效率40.8％，為CS/pDNA和PCS/pDNA二元基因遞送系統(tǒng)的30.4和50.0倍;在EC-1細(xì)胞上，當(dāng)N/C/P比為10∶1∶1時(shí)，CS/PG/pDNA-Ⅲ三元基因遞送系統(tǒng)達(dá)到最大基因轉(zhuǎn)染效率11.6％，為CS/pDNA和PCS/pDNA二元基因遞送系統(tǒng)的1.9和3.7倍。以γ-PGA為抑制劑，攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)經(jīng)由γ-PGA特異性受