大孔徑新型介孔材料用于生物質譜基質及蛋白分子特異性富集和酶解載體的研究.pdf

1、本論文工作的主要貢獻是研究了多種不同的新型無機介孔材料在生物質譜以及蛋白分子特異性富集和快速酶解技術中的首次應用，對將生物分析科學與介孔材料科學領域的結合進行了探索性的研究，具有一定的理論和現(xiàn)實意義。 生物質譜在最近的20多年間得到了迅猛的發(fā)展。由于其信號檢測靈敏、速度快以及種類多樣化的優(yōu)點，生物質譜已經成為生物分析領域中最前沿研究如蛋白組學研究的支撐技術。其中，以基質輔助激光解吸(MALDI)為離子化方法、以飛行時間(TOF)

2、為質量分析器的生物質譜，具有良好的質量精度、分辨率和靈敏度，且操作簡便，常常被用于分子量大于500的肽段測定和通過肽質量指紋譜(PMF)進行蛋白鑒定。另一方面，實際的生物分析樣品大多是組成復雜的混合物，在進行生物質譜測定之前需要進行分離、富集等處理；在進行肽段分析之前，蛋白樣品也需進行徹底的酶解反應。目前，隨著低豐度的后修飾蛋白的深入研究和以小分子為對象的代謝組學的興起，進一步發(fā)展生物質譜技術對于小分子樣品的分析、低豐度蛋白的富集和快速

3、酶解新技術顯得尤為重要。 自90年代初，介孔材料MCM-41首次被合成以來，介孔材料的制備方法得到了不斷的完善，已日趨成熟，這使得介孔材料的種類和結構也得到不斷地創(chuàng)新和突破。新型的介孔材料具有不同的組成、較高的比表面積、較大的孔徑、開放的孔道等特點，在吸附、催化、光學和電子器件等方面有著潛在的應用前景。目前，如何將合成的介孔材料投入到實際應用中去是材料學家們思考的焦點問題，尤其是隨著介孔材料對生物分子吸附行為的不斷研究，與生物分

4、子具有相融性的介孔材料在生物技術中的應用越來越引起人們的關注。同時，將介孔材料應用到生物技術中也為解決現(xiàn)存的生物分離、分析技術問題提供了新的切入點。 本論文工作共包括以下三個部分： 第一部分介孔MALDI基質的研究 有機基質的引入使得MALDI質譜在生物分子的分析領域中取得了成功而廣泛的應用。但同時有機基質本身也存在著一些不可避免的問題，如低分子量范圍內的復雜背景的存在嚴重影響了小分子樣品的測量，有機基質的MAL

5、DI對生物樣品中的共存金屬鹽的耐受度也很有限，鹽對質譜信號的抑制作用明顯。無機材料作為MALDI基質的研究一直受到關注，尤其是近幾年，無機基質的靈敏度和產生的譜圖效果都有了進一步的提高。 本論文研究了介孔材料作為無機基質在質譜中的應用。實驗結果發(fā)現(xiàn)，不同組分的介孔材料對分析物的電離能力表現(xiàn)出極大差異，材料對樣品的電離能力與其紫外吸收趨勢相一致，即紫外吸收越強，電離能力越強。以紫外吸收強的氧化鈦-氧化鈰混合氧化物(CeTiO)為基

6、質檢測低皮摩爾級濃度的聚丙酸甘油(PPG)，可以得到信噪比良好的譜圖，這相對于已有文獻所報道的納摩爾級檢測水平有了很大的提高。以標準的環(huán)十肽Gramicidin S為樣品分別測試了四種具有不同孔結構的氧化鈦-氧化鎢混合氧化物(WTiO)作為MALDI基質時的質譜信號，發(fā)現(xiàn)以有序介孔材料作為基質解吸得到的樣品離子強度明顯高于無孔和無序介孔材料，其原因可能是有序介孔結構既為吸附生物分子提供了高的比表面積，同時又有利于樣品分子的解吸過程。利用

7、有序介孔基質成功地檢測到低分子量小肽，彌補了有機基質的弱點。相對于有機基質，介孔材料也顯示出極好的耐鹽性，樣品溶液中共存的鉀鹽成份并沒有抑制肽信號的檢測，相反地，可以有效地提升樣品的信號強度。在優(yōu)化了的樣品制備條件下，有序介孔基質對復雜的馬心肌紅蛋白的酶解肽段進行檢測，并利用PMF方法成功完成蛋白鑒定；同時選擇了較短的酶解肽段HKIPIK進行了有效的串級質譜分析。本部分的研究顯示有序介孔無機基質有望在小分子(如藥物分子)和生物短肽的MA

8、LDI-TOFMS分析中得到廣泛的應用。 第二部分介孔氧化鐵對生物分子的特異性 富集磷酸化修飾是蛋白組學中蛋白翻譯后修飾研究的重要內容。由于磷酸化蛋白質在生物體內的含量很低，以及磷酸肽在正離子模式質譜中的離子化效率較低，所以在對它的質譜檢測和位點分析之前需要進行富集、分離預處理。目前最廣泛采用的磷酸化肽段富集技術是固定金屬親和色譜法(IMAC)，此方法中，鍵合在螯合底物上的金屬離子(通常是Fe3+或Ga3+)選擇性地與磷

9、酸化肽相結合，并且在高pH或磷酸緩沖液中可以釋放出磷酸化肽，從而實現(xiàn)其與非磷酸化肽的分離。但該方法操作復雜，混合液中含有帶較多酸性殘基的肽段時的親和選擇性較低，雖然利用其螯合鐵填料直接點樣進行質譜檢測可以簡化操作，但對多磷酸化肽段具有一定的歧視效應。 本論文發(fā)展了一種利用介孔氧化鐵對磷酸化肽段進行富集分離、直接進行靶上點樣分析的簡易新方法。首先利用尿素和甲醛的縮聚來誘導氫氧化鐵溶膠粒子間的聚集、高溫焙燒獲得晶化了的大孔徑氧化鐵微

10、球材料，然后將大孔徑氧化鐵微球材料用于磷酸化肽段的富集分離。通過一系列的富集條件優(yōu)化實驗，選擇在含有30％乙腈、0.1％乙酸的溶液中進行氧化鐵微球分別對非磷酸化和磷酸化磷蛋白混合物、磷酸化蛋白混合物的酶解肽液中的磷酸化肽段進行的選擇性親和吸附，離心、去上層清液后，利用pH值為10的氨水溶液重新分散氧化鐵沉淀，將所得氧化鐵顆粒懸浮液直接點樣后進行質譜分析，結果顯示出介孔氧化鐵對磷酸化肽段具有快速、有效的富集分離能力。與傳統(tǒng)IMAC方法相比

11、較，介孔氧化鐵富集技術步驟簡單，具有更高的親和選擇性。而且，這種直接點樣的方法對多位點的磷酸化肽段也能夠實現(xiàn)有效的富集、檢測。同時，通過與商品化無孔的納米氧化鐵材料富集效果的比較，證明介孔氧化鐵的介孔表面在高效的磷酸化肽段富集中發(fā)揮了重要的作用。 第三部分介孔材料在蛋白酶解中的應用 胰蛋白酶酶解反應是蛋白組學研究中利用質譜進行蛋白鑒定之前所必需的關鍵步驟。目前，蛋白組學研究中最普遍的蛋白質酶解方法包括膠上酶解和溶液酶解，

12、但這兩種酶解方法都需要較長的反應時間(數(shù)小時至過夜)，一定程度地限制了蛋白組學研究中蛋白分析的快速、高通量要求，而固定化酶技術可以極大地提高酶解速度到秒級。本論文利用大孔徑硅質介孔泡沫材料(MCF)作為酶固定化材料以及毛細管柱填料，對蛋白柱上酶解進行初步探索。通過蛋白自動進樣系統(tǒng)，溶解在碳酸緩沖液中的標準馬心肌紅蛋白，在以純水為流動相的條件下，經過裝有已固定蛋白酶的二氧化硅介孔泡沫填料的毛細管柱，流出液直接點靶板進行質譜分析，結果表明該

13、酶解技術方法快速、高效，在秒級的酶解反應時間內，酶解肽段覆蓋率達95.42％，遠遠高于相同時間內傳統(tǒng)溶液酶解所得肽段的覆蓋率(26.79％)。而用孔徑較小的SBA-15作載體的毛細管柱酶反應器所得的酶解肽段覆蓋率僅為22.22％，原因可能是介孔泡沫的超大孔徑能夠保證蛋白在柱中已吸附有蛋白酶的介孔孔道里自由擴散，大大增加了蛋白與酶的接觸機率，從而提高了酶解效率。利用大孔徑MCF材料填充的毛細管柱酶反應器還具有可在常溫下進行酶解、可重復使用