pkaR基因?qū)熐姑劝l(fā)孢子凋亡的影響_3358.pdf

1、目的：煙曲霉是一種條件致病菌，人體依靠肺巨噬細(xì)胞清除吸入的煙曲霉孢子。煙曲霉是最普遍的可引起侵襲性曲霉病的病原體，由于許多抗真菌藥物毒性大、效率低和不斷增長(zhǎng)的抗藥性使可使用的抗真菌療法變得非常有限。激活煙曲霉內(nèi)生的凋亡成為對(duì)抗侵襲性曲霉病和其他真菌引發(fā)疾病的新希望。更多了解凋亡相關(guān)基因可以為發(fā)展新的抗真菌藥物提供理論依據(jù)。蛋白激酶 A對(duì)于多種真菌的生長(zhǎng)、形態(tài)及毒性等都有著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。人體依靠氧化壓力清除體內(nèi)萌發(fā)的煙曲霉孢子，而蛋

2、白激酶A是多種真核生物的壓力應(yīng)答調(diào)節(jié)器，pkaR為蛋白激酶A的調(diào)節(jié)亞基，因此，研究pkaR基因在氧化壓力下對(duì)煙曲霉萌發(fā)孢子凋亡的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制，具有重要的生物醫(yī)學(xué)意義。
　　方法：比較野生株和pkaR基因缺失突變株的萌發(fā)孢子在氧化壓力條件下的凋亡參數(shù)，來(lái)研究pkaR基因是否參與煙曲霉在氧化壓力下凋亡的調(diào)控。培養(yǎng)野生株和pkaR基因缺失突變株的萌發(fā)孢子，選擇雙氧水作為氧化壓力與萌發(fā)孢子孵育。萌發(fā)孢子經(jīng)過(guò)氧化壓力刺激后，通過(guò)亞甲基藍(lán)

3、染色和再生實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)氧化壓力刺激后萌發(fā)孢子活性；DCFH-DA染色檢測(cè)在相同氧化壓力條件下野生株和突變株萌發(fā)孢子內(nèi)的ROS產(chǎn)生情況；TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)萌發(fā)孢子的DNA斷裂情況，作為判斷萌發(fā)孢子凋亡情況的依據(jù)；PI染色檢測(cè)經(jīng)氧化壓力作用后萌發(fā)孢子細(xì)胞膜的完整性。
　　結(jié)果：亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)氧化壓力處理pkaR基因缺失突變株萌發(fā)孢子的存活率明顯高于野生株；胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)結(jié)果顯示，較低強(qiáng)度的氧化壓力條件下WT株萌發(fā)孢子的RO

4、S產(chǎn)生被促進(jìn)，較高強(qiáng)度的氧化壓力條件下ROS產(chǎn)生被抑制，與野生株相反突變株在較低氧化壓力條件下ROS產(chǎn)量低，較高氧化壓力條件下ROS產(chǎn)量高，在氧化壓力條件下野生株和突變株萌發(fā)孢子的ROS含量有顯著差異；TUNEL實(shí)驗(yàn)表明，隨著氧化壓力的提高，野生株凋亡的萌發(fā)孢子數(shù)量經(jīng)歷升高再降低的過(guò)程，而突變株凋亡的萌發(fā)孢子數(shù)量無(wú)顯著變化，野生株與突變株相比凋亡的萌發(fā)孢子數(shù)量有顯著差異；PI實(shí)驗(yàn)表明，在氧化壓力條件下WT株的萌發(fā)孢子細(xì)胞膜受到的損傷更大

5、，即壞死細(xì)胞更多，與突變株相比對(duì)于氧化損傷的抵抗能力更弱。
　　結(jié)論：亞甲基藍(lán)染色作為一種檢測(cè)菌體存活率的方法，可以應(yīng)用于煙曲霉萌發(fā)孢子活性的檢測(cè)中；pkaR基因敲除后突變株的萌發(fā)孢子存活率更高，對(duì)于氧化壓力的敏感性降低，說(shuō)明pkaR基因影響煙曲霉萌發(fā)孢子對(duì)于氧化損傷的抵抗；經(jīng)氧化壓力刺激后，野生株與突變株的 ROS產(chǎn)量有顯著差異，說(shuō)明 pkaR基因參與調(diào)節(jié)煙曲霉萌發(fā)孢子ROS產(chǎn)生；在相同氧化壓力條件下，野生株與突變株凋亡的萌發(fā)孢