曲霉孢子萌發(fā)中葡萄糖氧化酶活性電化學(xué)檢測(cè)方法初步研究.pdf

1、孢子是生物體產(chǎn)生的一種具有繁殖或休眠作用的特殊生命形式，能在惡劣的環(huán)境下保持自有的傳播能力，并再在有利條件下直接發(fā)育成新個(gè)體。盡管孢子被認(rèn)為是代謝惰性的，但它們卻是極好的酶貯藏庫和非常有前景的生物催化劑，更是生命繁殖的重要階段，研究孢子萌發(fā)中的活性物質(zhì)變化可為有效利用或控制其活體提供理論基礎(chǔ)。常規(guī)的研究方法如光度法、色譜法所需儀器龐大、能耗高、昂貴，且不能進(jìn)行對(duì)活體實(shí)時(shí)、原位研究。電化學(xué)方法具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)快速等特點(diǎn)，掃描電

2、化學(xué)顯微分析在實(shí)現(xiàn)生物體系實(shí)時(shí)、原位、無損以及在線分析的同時(shí)，還可進(jìn)行微區(qū)生物活性成分分析，基于此，我們提出采用電化學(xué)方法研究孢子萌發(fā)過程中活性成分的新方法及新思路。本文以食品、醫(yī)藥、化工、生物技術(shù)等行業(yè)中有廣泛應(yīng)用的微生物來源葡萄糖氧化酶(GOx)為研究對(duì)象，采用電化學(xué)方法研究了曲霉孢子的不同生長階段的GOx活性，為進(jìn)一步開發(fā)曲霉孢子作為GOx生物催化劑，或作為有害曲霉菌的抑制靶點(diǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，具體結(jié)果如下:
　　(1

3、)建立定量檢測(cè)GOx酶活的電化學(xué)循環(huán)伏安方法。巧妙地引入二茂鐵甲醇(Fc)作為氧化還原探針，獲取GOx催化反應(yīng)中的電子傳遞信號(hào)，以玻碳電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極、鉑絲電極為對(duì)電極，對(duì)不同酶濃度的磷酸緩沖溶液，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在酶濃度為0.128～2.377 U/mL的范圍內(nèi)，響應(yīng)峰電流與酶濃度之間具有良好的線性關(guān)系，其回歸方程為:I[10-5A]=4.427·E[U]+14.054，相關(guān)系數(shù)為0.998，檢

4、測(cè)下限為0.128U/mL。采用樣品加標(biāo)法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，回收率在97.208％～104.538％之間。在采用電化學(xué)方法的同時(shí)采用傳統(tǒng)的滴定法測(cè)定酶活進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果表明，循環(huán)伏安法檢測(cè)GOx酶活力準(zhǔn)確可靠，且操作更加簡便快速。
　　(2)電化學(xué)循環(huán)伏安法測(cè)定黑曲霉孢子萌發(fā)過程中GOx酶活?；谏险陆⒌碾娀瘜W(xué)循環(huán)伏安法測(cè)定GOx酶活的方法，提出電化學(xué)循環(huán)伏安法測(cè)定黑曲霉孢子中GOx酶活的原理與方法，并將該法應(yīng)用于測(cè)定黑曲霉孢子萌發(fā)

5、過程中GOx酶活性的變化，同時(shí)采用生物顯微鏡觀察了黑曲霉孢子的生長情況，獲得了黑曲霉孢子萌發(fā)過程中的GOx酶活變化。結(jié)果表明，在96孔板中培養(yǎng)0～4h，孢子還未萌發(fā)，孢子的酶活力沒有明顯變化。在第4～10h，孢子迅速萌發(fā)，孢子的GOx酶活力逐漸增強(qiáng)，在第8h達(dá)到最高為2.13 U/mL。第10～16h，孢子萌發(fā)完全，孢子的GOx酶活力又恢復(fù)到最初的水平。同時(shí)使用滴定法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示兩種方法結(jié)果近似。
　　(3)掃描電化學(xué)顯

6、微鏡(SECM)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)黃曲霉單孢子萌發(fā)過程的形貌和GOx酶活變化。基于循環(huán)伏安法檢測(cè)GOx的原理，結(jié)合SECM，實(shí)時(shí)、在線研究了黃曲霉孢子萌發(fā)過程中的形貌與GOx酶活變化。用聚苯乙烯的培養(yǎng)皿固定黃曲霉孢子，以Fc作為氧化還原介質(zhì)，10μm的鉑微電極為探針，銀/氯化銀為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，利用SECM技術(shù)對(duì)單個(gè)黃曲霉孢子進(jìn)行成像，觀測(cè)黃曲霉孢子從休眠到萌發(fā)過程中的形貌，同時(shí)檢測(cè)萌發(fā)過程中的GOx活性變化。結(jié)果表明，隨著孢子萌發(fā)