血管細胞粘附分子-1在骨關節(jié)炎發(fā)病機制中的初步研究.pdf

1、骨關節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種多因素所致的慢性進行性疾病,諸多因素在其發(fā)生及發(fā)展的過程中起著重要的作用。研究表明,血管細胞粘附分子-1(Vascularcelladhesionmolecule1,VCAM-1)可能在骨關節(jié)炎的發(fā)病中扮演著重要的角色,但其具體作用機制尚未明確。
　　目的：
　　本研究首先通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)及V

2、CAM-1單克隆抗體的免疫組織化學染色,對正常人及骨關節(jié)炎患者的血清、關節(jié)滑膜及軟骨組織中的VCAM-1進行測定并比較。其次研究人正常軟骨細胞與骨關節(jié)炎軟骨細胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定,對其生物學特性進行對照并評價其生物學活性,為進一步研究人軟骨細胞的其他生物學特性及骨關節(jié)炎的發(fā)病機制提供實驗基礎。并且通過RT-PCR及Westernblot實驗,從細胞的基因及蛋白水平對所獲得的人正常及骨關節(jié)炎軟骨細胞的VCAM-1的表達進行比較,并對不

3、同濃度IL-1β作用下人正常軟骨細胞的VCAM-1的表達進行比較,初步探討VCAM-1在骨關節(jié)炎發(fā)病機制中的作用,為進一步揭示VCAM-1在骨關節(jié)炎發(fā)病中的具體作用機制提供實驗依據。
　　方法：
　　1.采用ELISA法分別對正常人及骨關節(jié)炎患者血清中的VCAM-1的表達進行測定;對正常及骨關節(jié)炎患者的關節(jié)滑膜及軟骨組織進行VCAM-1單克隆抗體免疫組織化學染色。
　　2.取人創(chuàng)傷性截肢的正常無菌膝關節(jié)軟骨與骨關節(jié)炎全

4、膝置換的膝關節(jié)軟骨,采用兩步酶消化法分離得到軟骨細胞,分別進行體外培養(yǎng)并傳代。通過倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài),繪制生長曲線,測細胞增殖,甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色對各代人正常軟骨細胞與骨關節(jié)炎軟骨細胞進行鑒定。
　　3.通過RT-PCR檢測VCAM-1mRNA以及Westernblot檢測VCAM-1蛋白,對所獲得的人正常及骨關節(jié)炎軟骨細胞中VCAM-1的表達進行比較。
　　4.通過RT-PCR及Western

5、blot實驗,從細胞的基因及蛋白水平對不同濃度IL-1β作用下人正常軟骨細胞的VCAM-1的表達進行比較。
　　結果：
　　1.各級骨關節(jié)炎患者的血清中VCAM-1的表達量都明顯高于正常對照組(P<0.05)。并且隨著骨關節(jié)炎程度的加重而增高。
　　2.骨關節(jié)炎患者的關節(jié)滑膜及軟骨組織中VCAM-1單克隆抗體免疫組織化學染色呈陽性,且隨著病變程度的加重,著色加深。各級骨關節(jié)炎患者關節(jié)軟骨中VCAM-1的表達都明顯高于正

6、常對照組(P<0.05),而且骨關節(jié)炎患者各級間VCAM-1的表達也具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),表明VCAM-1的表達量也隨著骨關節(jié)炎程度的加重而增高。
　　3.經過兩步酶消化法分離的原代正常軟骨細胞為球形,培養(yǎng)2-3天,細胞貼壁、變形,呈三角形或多角形,1周后細胞增殖明顯,約2周左右,細胞融合成層。傳代后第1代細胞貼壁時間較原代細胞短,增殖速度加快。但隨傳代次數增加,增殖速度漸減慢,細胞形態(tài)逐漸向“纖維樣”細胞轉化。而骨關節(jié)

7、炎軟骨細胞形態(tài)似成纖維細胞,生長速度明顯較正常軟骨細胞慢。
　　4.MTT實驗結果顯示,正常軟骨細胞5代以內的生長曲線呈“S”型。而骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖低于正常組,傳至第4代其生物學特征已基本消失。
　　5.甲苯胺藍染色顯示,正常軟骨細胞內可見藍紫色異染顆粒,細胞周圍有少量的異染顆粒出現(xiàn)。經多次傳代培養(yǎng)后,軟骨細胞甲苯胺藍染色正染呈淺藍色。而骨關節(jié)炎軟骨細胞以正染藍色為主,經多次傳代后細胞基本無藍色。
　　6.Ⅱ型膠原

8、免疫組織化學染色顯示,正常原代軟骨細胞著色為棕黃色,呈陽性,細胞核周圍呈黃褐色,可見黃褐色顆粒在細胞周圍。細胞經傳代后棕黃色著色漸減弱,5代以后軟骨細胞呈成纖維化,突起增多,染色變淡。而骨關節(jié)炎軟骨細胞原代染色為棕黃色,經多次傳代后基本無棕黃色著色。
　　7.所獲得的人骨關節(jié)炎軟骨細胞中VCAM-1mRNA的量及蛋白的表達量明顯較正常軟骨細胞高。
　　8.IL-1β干預組的人正常軟骨細胞中VCAM-1mRNA的量以及VCAM

9、-1的蛋白量表達明顯高于空白對照組,且隨IL-1β濃度增加,其亦有增高的趨勢。
　　結論：
　　1.血清、關節(jié)滑膜及軟骨組織中VCAM-1的表達與骨關節(jié)炎密切相關,且隨病變的加重其表達量增加。
　　2.采用胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法可以獲得人正常及骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨細胞。正常軟骨細胞5代以內細胞生長良好,生物學特性明顯,適合于實驗研究,5代以后出現(xiàn)去分化現(xiàn)象;骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖慢,生物學特征退變早,符合軟骨細胞退變

10、的表現(xiàn)。這為骨關節(jié)炎軟骨細胞水平的研究提供了實驗基礎。
　　3.人骨關節(jié)炎軟骨細胞VCAM-1的表達明顯高于正常軟骨細胞,證實了本研究中所獲得的細胞具有代表性,可以作為后續(xù)研究骨關節(jié)炎發(fā)病機制中的模型細胞,為下一步揭示VCAM-1在骨關節(jié)炎發(fā)病中的具體作用機制提供了實驗依據。
　　4.IL-1β干預組的人正常軟骨細胞中VCAM-1的表達明顯高于空白對照組,且隨IL-1β濃度增加,其亦有增高的趨勢。這一結果證實了VCAM-1的