基于細(xì)胞培養(yǎng)的銀杏黃酮類化合物的分離鑒定研究.pdf

1、銀杏是我國(guó)的珍貴樹種,其特有的活性物質(zhì)黃酮具有抗氧化、抑菌消炎、抗癌和防治心腦血管疾病等諸多功效,開發(fā)前景光明。為滿足日益擴(kuò)大的市場(chǎng)需求,發(fā)展銀杏深加工產(chǎn)業(yè),利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)銀杏黃酮為工業(yè)生產(chǎn)提供原料是一條有效途徑。本文在前人的研究基礎(chǔ)上,對(duì)銀杏愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代及懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)的研究;建立了銀杏黃酮糖苷的熒光光譜檢測(cè)方法;以收獲的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)象,優(yōu)化了加熱回流提取及超聲波提取工藝參數(shù),推導(dǎo)了顯著提取因子對(duì)

2、黃酮糖苷得率的模型方程;并探討了黃酮糖苷提取動(dòng)力學(xué)過程;推測(cè)了黃酮糖苷種類;對(duì)銀杏細(xì)胞黃酮體外抗氧化及抑菌活性進(jìn)行了驗(yàn)證,得到如下結(jié)論:
　　1.在細(xì)胞誘導(dǎo)試驗(yàn)中,培養(yǎng)基以DCR為好,添加激素BA可以提高誘導(dǎo)率。但在繼代培養(yǎng)中MS培養(yǎng)基和激素KT在促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)方面有積極作用?；钚蕴孔鳛槲絼?雖然對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的抑制作用,但是在黃酮積累上起到促進(jìn)作用。
　　2.蔗糖在懸浮培養(yǎng)中有利于銀杏細(xì)胞生長(zhǎng),葡萄糖利于黃酮合

3、成,硝態(tài)氮和氨態(tài)氮混合能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng),但對(duì)黃酮的合成來講硝態(tài)氮更為有利。接種量40g/L、裝液量100mL、封口膜封口、添加前體物苯丙氨酸以及24h光照為培養(yǎng)高產(chǎn)黃酮銀杏細(xì)胞的較優(yōu)條件,添加檸檬酸能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),而維生素C(Vc)既有利于黃酮的合成,又對(duì)細(xì)胞的褐化抑制效果較好。
　　3.建立了熒光光譜法測(cè)定銀杏細(xì)胞總黃酮的檢測(cè)方法,結(jié)果表明,以蘆丁為標(biāo)樣,純甲醇溶解,10％Al(NO3)3添加4mL,pH3.6的乙酸-乙酸鈉2.

4、5mL條件下,熒光強(qiáng)度與蘆丁濃度成線性關(guān)系,回歸方程為y=29.92x+36.49(R2=0.986),線性范圍1.8×10-6-3.2×10-5mol/L,加標(biāo)回收率為101.3%。該方法靈敏度高,重現(xiàn)性好,操作簡(jiǎn)單,成本低,具有良好的應(yīng)用前景。
　　4.利用響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化了銀杏懸浮細(xì)胞中黃酮糖苷加熱回流乙醇提取工藝,得出影響提取得率的顯著因素(提取時(shí)間、提取溫度和乙醇濃度)的二次多項(xiàng)式模型。最佳提取條件為:提取時(shí)間3.

5、2h、提取溫度76.85℃、乙醇濃度72.05%。此條件下黃酮糖苷提取得率為1.81%,與模型預(yù)測(cè)值一致,說明利用RSM優(yōu)化提取條件,建立的模型預(yù)測(cè)銀杏細(xì)胞黃酮糖苷準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性好。
　　5.利用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),建立了超聲波法以提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率和乙醇濃度為自變量,黃酮得率為因變量的二次回歸方程。最優(yōu)工藝為以純乙醇作提取溶劑,在超聲功率500W條件下于80℃提取50min。此條件下所得到的黃酮糖苷得率為3

6、.03%,與模型預(yù)測(cè)值吻合,相對(duì)誤差較小,說明此二次回歸方程可用于實(shí)際生產(chǎn)中銀杏黃酮糖苷的預(yù)測(cè)。
　　6.以懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為原料,在Fick第一定律的基礎(chǔ)上,推導(dǎo)了黃酮糖苷乙醇浸提的動(dòng)力學(xué)模型,考察了提取溫度對(duì)黃酮糖苷質(zhì)量濃度的影響,計(jì)算了不同溫度下黃酮糖苷的平衡質(zhì)量濃度,求得了表觀速率常數(shù)以及提取過程表觀活化能。
　　驗(yàn)證試驗(yàn)表明,黃酮糖苷質(zhì)量濃度和相對(duì)萃余率的理論值和實(shí)際值在0-360min范圍內(nèi)基本吻合,說明建立的動(dòng)力學(xué)

7、模型是能夠用來描述銀杏細(xì)胞黃酮糖苷的實(shí)際提取過程的。
　　7.利用HPLC-UV-ESI-MSn法在350nm波長(zhǎng)下,50-1000m/z正離子模式質(zhì)譜檢測(cè)了槲皮素、山萘酚和異鼠李素3種苷元的裂解規(guī)律。并在相同的色譜、質(zhì)譜條件下對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞黃酮提取物中黃酮類化合物進(jìn)行了鑒定。推測(cè)了8種黃酮糖苷,分別為:槲皮素-3-O[2-O,6-O-(α-L-二鼠李糖基)]-β-D-葡萄糖苷;山萘酚-3-O[2-O,6-O-(α-L-二鼠李糖基)]

8、-β-D-葡萄糖苷;楊梅黃酮--3-O[6-O-(α-L-鼠李糖基)]-β-D-葡萄糖苷;槲皮素-3-O[2-O-(α-L-鼠李糖基)]-β-D-葡萄糖苷;異鼠李素-3-O[6-O-(α-L-鼠李糖基)]-β-D-葡萄糖苷;山萘酚-3-O[6-O-(α-L-鼠李糖基)]-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-對(duì)香豆酰)-β-D-葡萄糖苷、山萘素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-對(duì)香豆酰)-β-D-葡萄糖苷。

9、>　　8.銀杏細(xì)胞黃酮糖苷的體外抗氧化及抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明:銀杏細(xì)胞黃酮糖苷對(duì)羥自由基和過氧化氫的清除率都顯著高于檸檬酸、植酸和Vc;對(duì)超氧陰離子的清除率低于Vc,對(duì)Fe2+的螯合能力和對(duì)植物油脂的抗自氧化能力,受試各濃度下均顯著高于陽(yáng)性對(duì)照。體外抑菌試驗(yàn)表明隨著黃酮濃度的增加,抑菌效果在增強(qiáng),受試濃度下抑菌圈直徑最大達(dá)2.2cm,最小為1.1cm,對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.141mg/mL。2.25mg/mL濃度作用10h時(shí)抑菌率達(dá)