AAV9-SERCA2a基因不同方法轉(zhuǎn)染SD大鼠心肌持效性及安全性評(píng)價(jià).pdf

1、目的：構(gòu)建滴度1×1012 vg/mL的rAAV9-hSERCA2a-EGFP病毒載體系統(tǒng)，研究不同心臟基因轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染AAV9-SERCA2a基因?qū)D大鼠心肌的持效性及對(duì)機(jī)體安全性的影響。
　　方法：根據(jù)細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法將hSERCA2a基因克隆到腺相關(guān)病毒載體中，與其包裝質(zhì)粒pAAV pHelper發(fā)生重組，通過(guò)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染人胚腎293（HEK293）細(xì)胞，酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定。110只

2、雄性SD大鼠隨機(jī)分為尾靜脈注射（Tail vein injection，TVI）組、心肌注射（Intramyocardial injection，IMI）組、心包腔注射（Intrapericardial injection，IPI）組，三組采用相應(yīng)方法在體分別轉(zhuǎn)染滴度1×1011vg/mL AAV9-SERCA2a-EGFP、AAV9-EGFP、NS各200μL，其中，TVI組根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒滴度不同又分為NS組、低劑量組（1×109 vg

3、/mL）、高劑量組（1×1011 vg/mL），各組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)滴度AAV9-SERCA2a-EGFP、AAV9-EGFP200μL。轉(zhuǎn)染28d熒光顯微鏡下觀察心肝腎組織綠色熒光表達(dá)情況，Western Blot技術(shù)檢測(cè)SERCA2a基因在大鼠各組織的相對(duì)表達(dá)量，體表12導(dǎo)聯(lián)心電圖檢測(cè)心律失常發(fā)生率，HE染色觀察病理學(xué)變化，心臟彩色多普勒超聲評(píng)價(jià)心功能，血液生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)肝腎功能。
　　結(jié)果：
　　1）酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒

4、定證明rAAV9-hSERCA2a-EGFP構(gòu)建成功，滴度高達(dá)1×1012 vg/ml。
　　2）三組左心室可見(jiàn)大量綠色熒光表達(dá)，IM I組熒光局限在注射點(diǎn)，三組肝腎組織均可見(jiàn)微弱熒光；三組心肌SERCA2a蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于肝腎（P<0.01），TVI組和IMI組心肌SERCA2a蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于IPI組（P<0.01）；TVI組和IPI組心電圖正常，IMI組2只大鼠發(fā)生室性早搏；三組轉(zhuǎn)染AAV9-EGFP、AAV9-

5、SERCA2a-EGFP與轉(zhuǎn)染NS相比，心功能、組織病理學(xué)、血液生化學(xué)指標(biāo)均無(wú)顯著差異（P>0.05）。
　　3）TVI法高劑量組心肌綠色熒光明顯高于低劑量組，高劑量組心肌SERCA2a蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于低劑量組（P<0.05）；低、高劑量組轉(zhuǎn)染AAV9-EGFP、AAV9-SERCA2a-EGFP與NS對(duì)照組相比，心律失常發(fā)生率、心功能、組織病理學(xué)、血液生化學(xué)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：