產(chǎn)殼聚糖酶細(xì)菌的篩選及其對(duì)綠豆和黃瓜立枯病的生物防治.pdf

1、本文的主要目的是分離篩選高產(chǎn)殼聚糖酶的微生物菌株，優(yōu)化產(chǎn)酶的發(fā)酵條件以及實(shí)現(xiàn)殼聚糖酶的純化和解析該酶的酶學(xué)特性，在此基礎(chǔ)上研究該菌株及其所產(chǎn)殼聚糖酶對(duì)兩種作物立枯的防治效果和可能的生防機(jī)制。 以殼聚糖為唯一碳源，通過透明圈法對(duì)100株植物內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行篩選，根據(jù)菌株所產(chǎn)透明圈的直徑與菌落直徑的比值，獲得15株具有較好產(chǎn)酶能力的細(xì)菌。搖瓶液體培養(yǎng)復(fù)篩表明，K7菌株的酶活最高，酶活力為1.17 μmol/mL。通過生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)合菌

2、株形態(tài)特征觀察初步鑒定K7菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。 分別對(duì)K7菌株產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵過程中的溫度、培養(yǎng)時(shí)間、轉(zhuǎn)速和裝液量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果顯示，在培養(yǎng)溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200 rpm條件下，菌株經(jīng)培養(yǎng)24 h后，以1﹪的接種量接入到100 mL LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 h，獲得最高的產(chǎn)酶活力，為17．41μmol/mL，是優(yōu)化前酶活力的14.90倍。 將K7菌株的發(fā)酵液離心后所得粗

3、酶液經(jīng)硫酸銨沉淀，使之達(dá)到80﹪的飽和度后，利用SephadexG-100柱層析進(jìn)一步純化。獲得2種活性組分，將對(duì)應(yīng)于第一個(gè)洗脫峰洗脫液合并，經(jīng)SDS-PAGE電泳后初步確定其分子量處于40KD-43KD之間。該酶對(duì)膠體殼聚糖、羧甲基纖維素(CMC)有降解能力，對(duì)膠體幾丁質(zhì)沒有降解能力。搖瓶培養(yǎng)表明，該菌殼聚糖酶的產(chǎn)生不需要?dú)ぞ厶钦T導(dǎo)。K7菌株所產(chǎn)的殼聚糖酶作用于脫乙酰度90﹪的殼聚糖較好的反應(yīng)條件是：最適pH值為5.6，最適溫度為55

4、℃，反應(yīng)時(shí)間15 min。 對(duì)峙法測(cè)定了PDA平板上K7菌株及其殼聚糖酶對(duì)立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)抑制作用，發(fā)現(xiàn)K7菌株和殼聚糖酶都能夠直接抑制病菌的生長(zhǎng)。植物活體上測(cè)定了K7菌株以及不同稀釋度的殼聚糖酶對(duì)綠豆和黃瓜兩種作物立枯病的防治效果，發(fā)現(xiàn)K7菌株可以有效降低病害的嚴(yán)重度，是一株具有應(yīng)用潛力的生防菌株。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的殼聚糖酶防治立枯病存在差異，一定范同內(nèi)隨著酶濃度的增大，防治效果提高。推測(cè)K