Toll樣受體4在阿霉素復(fù)制的小鼠局灶性節(jié)段性腎小球硬化腎病模型中作用的研究.pdf

1、目的
　　TLRs是先天性免疫受體家族之一，近年研究發(fā)現(xiàn)通過其內(nèi)源性配體具有觸發(fā)炎癥和組織修復(fù)的作用，在腎小球疾病患者非選擇性蛋白尿中存在纖維蛋白原等TLR4內(nèi)源性配體，足細(xì)胞表面又表達(dá)TLR4，因而提出非選擇性蛋白尿中存在的TLR4內(nèi)源性配體能夠激活TLR4信號(hào)通路，引起炎癥因子釋放，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷及腎小球進(jìn)行性硬化。本研究將應(yīng)用免疫組化方法檢測阿霉素誘導(dǎo)的小鼠腎小球硬化模型腎組織中的TLR4、Fibrinogen、NF-KB、

2、MCP-1及TGF-β1的表達(dá)，探討TLR4在腎小球硬化機(jī)制中的作用及可能機(jī)制。
　　材料與方法
　　一、阿霉素腎病模型建立
　　SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠50只，體重20±2克，6-8周齡。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(40只)，對照組（10只）。實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈一次性注入阿霉素10mg/kg,對照組小鼠尾靜脈一次注射等量生理鹽水，以標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由攝食及飲水。
　　二、標(biāo)本收集
　　各組均于注射阿霉素前一天、注射

3、阿霉素第1周、2周、4周及6周用代謝籠收集24小時(shí)尿液;對照組于第6周，實(shí)驗(yàn)組于收集尿液結(jié)束當(dāng)天各取小鼠6只4％水合氯醛麻醉，下腔靜脈采血，用于血清白蛋白、膽固醇、甘油三酯及尿素氮、肌酐的測定;剖腹取腎，留取腎組織標(biāo)本，用于光鏡、電鏡及免疫組化檢查。
　　三、檢測指標(biāo)
　　采用柳氮磺酸比濁法檢測尿蛋白定量，應(yīng)用自動(dòng)生化儀檢測血清白蛋白、膽固醇、甘油三酯及尿素氮、肌酐水平;腎組織進(jìn)行HE、PAS染色及透色電鏡檢查;應(yīng)用免疫組化

4、法檢測腎組織中TLR4、Fibrinogen、NF-KB、MCP-1及TGF-β1的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　一、尿蛋白及血生化指標(biāo)
　　實(shí)驗(yàn)組尿蛋白從第1周開始增加，第2周達(dá)高峰，4周、6周與2周相比稍有下降，但與對照組相比均有顯著性差異(p＜0.01，0.01);血清白蛋白(ALB)于第1周開始下降(p＜0.01)，2周達(dá)最低值，4周、6周較2周稍升高，但仍處低水平狀態(tài)，與對照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01，0.

5、01);甘油三脂(TG)、膽固醇(ChoL)于第1周開始升高(p＜0.01)，第2周達(dá)高峰，第4、6周較第1、2周下降，但仍處于高水平狀態(tài)(p＜0.01，0.01);尿素氮(BUN)于第1周開始升高，第2周達(dá)高峰，第4、6周較第1、2周稍有下降，但仍處于高水平狀態(tài)(p＜0.01，0.01);肌酐(Cr)無顯著性升高。
　　二、光鏡
　　實(shí)驗(yàn)組第1周腎小球無明顯變化，腎小管可見蛋白管型;第2周部分腎小球可見節(jié)段性硬化，腎小管蛋

6、白管型增多，較易見到;第4周、6周可見50％以上腎小球中出現(xiàn)節(jié)段性硬化，腎小管擴(kuò)張明顯，可見大量蛋白管型及局部間質(zhì)纖維化;對照組腎小球及腎小管無變化。
　　三、電鏡
　　實(shí)驗(yàn)組于第1周偶可見足突融合，第2周足突融合更廣泛，第4周、6周出現(xiàn)足突融合變形，體積變大，胞質(zhì)中微絲增多，并出現(xiàn)囊泡及包涵體，毛細(xì)血管袢閉塞，充血，大量紅細(xì)胞填塞，內(nèi)皮細(xì)胞孔消失，基底膜正常。對照組足突清晰完整，未見融合。
　　四、TLR4、Fibr

7、inogen、NF-KB、MCP-1及TGF-β1的免疫組化染色結(jié)果
　　正常對照組TLR4少量表達(dá)于腎小球足細(xì)胞的胞膜及胞漿。免疫組化半定量分析顯示，TLR4在阿霉素腎病不同組別中的平均光密度依次遞增。實(shí)驗(yàn)組2周、4周、6周與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);Fibrinogen在阿霉素腎病不同組別中的表達(dá)依次遞增，實(shí)驗(yàn)組1周、2周、4周、6周與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均是P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)組之間比較也均有統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)差異(均是P＜0.01);NF-κB在阿霉素腎病不同組別中的表達(dá)逐漸增加，實(shí)驗(yàn)組1周、2周、4周、6周與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均是P＜0.01);MCP-1在阿霉素腎病的不同組別中表達(dá)依次遞增，實(shí)驗(yàn)組1周、2周、4周、6周組與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01);TGF-β1在阿霉素腎病實(shí)驗(yàn)組1周時(shí)與對照組相比表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)組2周、4周、6周組與對照組

9、相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均是P＜0.01）。
　　結(jié)論
　　1.單次鼠尾靜脈注射10mg/kg阿霉素可成功的誘導(dǎo)BALB/c小鼠局灶節(jié)段性腎小球硬化模型。
　　2.我們用免疫組化染色的方法證實(shí)了小鼠腎小球足細(xì)胞上結(jié)構(gòu)性的表達(dá)TLR4。
　　3.纖維蛋白原是TLR4的內(nèi)源性配體，在阿霉素腎病小鼠腎小球內(nèi)纖維蛋白原表達(dá)增高，與足細(xì)胞TLR4、NF-KB、MCP-1、TGF-β1的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示TLR4信號(hào)通路