扶正濟(jì)世液及紛樂(lè)治療NOD小鼠干燥綜合征及機(jī)理的研究.pdf

1、扶正濟(jì)世液及紛樂(lè)治療NOD小鼠 干燥綜合征及機(jī)理的研究 干燥綜合征(Sj Sgren’s syndrome，SS)是一種以侵犯唾液腺、淚腺等外分泌腺體為主的慢性炎癥性自身免疫疾病。臨床表現(xiàn)為口干、進(jìn)食甚至講話困難，猖獗性齲齒、眼干澀、異物感、少淚甚至無(wú)淚。約有2/3患者出現(xiàn)外分泌腺體外的系統(tǒng)損害，包括肌肉、關(guān)節(jié)、消化、呼吸、皮膚、泌尿系統(tǒng)等。SS患者90％以上為女性，發(fā)病年齡大多為40～60歲。根據(jù)對(duì)國(guó)內(nèi)萬(wàn)余人群的臨床調(diào)

2、查，本病的患病率為O.29％～0.77％，老年人群中患病率為3％～4％。 盡管SS的發(fā)病機(jī)制尚不明了，但許多研究表明白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在SS自身免疫反應(yīng)損害唾液腺和淚腺組織的過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。IL-1β、TNF-α可明顯抑制唾液腺的基礎(chǔ)分泌和刺激后分泌，同時(shí)增加膠原酶的產(chǎn)生，并促進(jìn)腺泡細(xì)胞合成基質(zhì)金屬蛋白酶Ⅱ，從而加劇腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。 由于SS原因未明，目前本

3、病尚無(wú)根治方法，主要是替代和對(duì)癥治療。糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑雖然可能有近期療效，但其不良反應(yīng)可能對(duì)患者產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此應(yīng)用受到限制。據(jù)報(bào)道中藥治療SS能改善病人的癥狀，提高生活質(zhì)量。本研究擬在較為公認(rèn)的SS動(dòng)物模型NOD小鼠上系統(tǒng)觀察扶正濟(jì)世液及免疫抑制劑紛樂(lè)(硫酸羥氯喹)的療效，并從其對(duì)IL一1β、TNF-α的影響方面探討其作用機(jī)理。 材料與方法 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只8周齡雌性NOD小鼠，體重20±2g，購(gòu)自上海斯萊

4、克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 2．實(shí)驗(yàn)分組：NOD鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。NOD鼠9周齡時(shí)開(kāi)始每天定時(shí)給藥1次。中藥組動(dòng)物給予扶正濟(jì)世液0.2m1．灌腸；羥氯喹(HCQ)組給予硫酸羥氯喹溶液0.4ml灌胃；對(duì)照組給予生理鹽水0.2ml灌腸。給藥量按動(dòng)物與人等效劑量換算表計(jì)算。 3．唾液流率測(cè)定： 在NOD小鼠9周、15周及20周齡時(shí)用濕重法測(cè)各組小鼠唾液流量，即用彎鑷子撿取小棉球1個(gè)，稱(chēng)重為M<,0>，然后置于小鼠舌下，

5、并用鑷子將其固定，10min后測(cè)棉球重量M<，1>，M<，1>-M<，0>即為小鼠唾液流率。 4．頜下腺組織學(xué)觀察： 每組在15周末以手術(shù)方法取左側(cè)頜下腺組織后縫合止血。20周末將動(dòng)物處死后取右側(cè)的頜下腺組織。置10％中性福爾馬林液中固定。石蠟包埋，5ixm切片。HE染色，觀察頜下腺的病理變化。淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)采用Chisholm和Mason的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，0級(jí)，無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；1級(jí)，輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；2級(jí)，中度浸潤(rùn)，即在每

6、4mm2小于1個(gè)浸潤(rùn)灶；每個(gè)浸潤(rùn)灶至少50個(gè)以上淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；3級(jí)，每4mm<'2>有一個(gè)浸潤(rùn)灶；4級(jí)，每4mm<'2>內(nèi)超過(guò)1個(gè)淋巴浸潤(rùn)灶。 5．頜下腺免疫組織化學(xué)染色： 采用SPA-HRP間接法。鏡下觀察到棕黃色反應(yīng)物質(zhì)為陽(yáng)性。所有切片均在同一放大倍數(shù)(×400)及同一光強(qiáng)度下分析，每張切片隨機(jī)采集5個(gè)視野，輸入彩色病理圖像測(cè)量系統(tǒng)，由計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，檢測(cè)平均灰度值。 6.頜下腺組織IL一1βmRNA和T

7、NF-αmRNA的表達(dá)： 采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)技術(shù)檢測(cè)。按照Trizol說(shuō)明書(shū)一步法提取組織總RNA。按照RT－PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用ChemiImager 5500凝膠成像分析系統(tǒng)的Fluorchem v2．O軟件測(cè)定電泳條帶密度值，IL－1β和TNF－amRNA的表達(dá)水平以該基因條帶密度占GAPDH基因條帶密度的百分比(％)表示。IL－1β和TNF－αtmRNA的表達(dá)水平以該基因條帶密度占GAPD

8、H基因條帶密度的百分比(％)表示。 7．血清IL－1β和TNF－α測(cè)定： 各組小鼠分別在9周、15周和20周齡時(shí)斷尾取血，常規(guī)分離血清，凍存于－30℃，同批以ELISA法檢測(cè)IL－1β和TNF－α濃度，按檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作。450nm讀取吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取各待測(cè)標(biāo)本含量。 8．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析： 結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差( ±s)表示，用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較采用方差分析，

9、自身前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為檢驗(yàn)顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 1．各組NOD小鼠唾液流率的變化：15周和20周齡時(shí)，中藥組及HCQ組與對(duì)照組相比，唾液流率明顯增加。 2．頜下腺組織學(xué)觀察 (1)頜下腺的病理變化：中藥組及HCQ組NOD小鼠頜下腺15周齡時(shí)表現(xiàn)為間質(zhì)有輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡呈卵圓形、大小不一，無(wú)聚集，導(dǎo)管排列稍紊亂，輕度擴(kuò)張。20周齡時(shí)表現(xiàn)為少量灶狀淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腺泡破壞、纖維增生。對(duì)照組NO

10、D小鼠15周齡時(shí)頜下腺可見(jiàn)間質(zhì)中有中度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分呈灶狀，導(dǎo)管壁中有輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡大小不等，腺體萎縮，部分已破壞、消失，出現(xiàn)纖維增生。對(duì)照組NOD小鼠20周齡時(shí)頜下腺可見(jiàn)間質(zhì)淋巴細(xì)胞重度浸潤(rùn)，形成淋巴灶，部分腺體變性萎縮，部分腺體上皮細(xì)胞脫落壞死。 (2)頜下腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)分級(jí)：中藥組及HCQ組15周齡NOD小鼠均在Chisholm和Mason標(biāo)準(zhǔn)的O～1級(jí)，20周齡NOD小鼠均在1～2級(jí)。對(duì)照組15周齡NOD

11、小鼠在2—3級(jí)，20周齡NOD小鼠在3～4級(jí)。 3．頜下腺免疫組織化學(xué)檢測(cè)的變化：免疫組化染色結(jié)果顯示，中藥組及HCQ組NOD小鼠頜下腺組織中IL一1β和TNF-α的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著低于對(duì)照組。對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于導(dǎo)管及腺泡上。 4．頜下腺組織IL一1βmRNA和TNF-αmRNA表達(dá)的變化：中藥組及HCQ組NOD小鼠頜下腺組織IL一1βmRNA和TNF-αmRNA的表達(dá)顯著低于對(duì)照組。 5．血清IL一1β和T

12、NF-α含量的變化：15周和20周齡時(shí)，中藥組及HCQ組與對(duì)照組相比，外周血血清的IL一1β和TNF-α含量明顯降低。1．扶正濟(jì)世液及羥氯喹不僅能減輕NOD小鼠逐漸加重的唾液腺分泌功能損害，而且延緩了NOD小鼠頜下腺的病理學(xué)改變。 2．IL-1β和TNF-α在NOD小鼠頜下腺局部及全身的水平與SS病情活動(dòng)程度密切相關(guān)。 3．扶正濟(jì)世液及羥氯喹明顯下調(diào)IL-1β和TNF-α在NOD小鼠頜下腺局部基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水