HBV前S2蛋白對(duì)信號(hào)分子LPA的影響及LPA對(duì)胰島素分泌的作用.pdf

1、目的：研究HBV pre-S2的表達(dá)與細(xì)胞核內(nèi)定位，pre-S2對(duì)水解性溶血磷脂酸(LPA)的溶血磷脂酶A1（LYPLA-1）啟動(dòng)子的反式激活作用，以及外源性LPA對(duì)胰島素分泌的影響，為進(jìn)一步研究乙型肝炎并發(fā)糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供研究線索與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴HBVpre-S2的表達(dá)與細(xì)胞核內(nèi)定位(1)HBV pre-S2和綠色熒光蛋白融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建:從乙肝患者血清中提取HBV DNA，設(shè)計(jì)帶HindⅢ、EcoRⅠ酶切位

2、點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增HBVpre-S2基因，膠回收后克隆入T-easy載體構(gòu)建pGEM-HBV-S2。HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切pGEM-HBV-S2和pcDNA3.1-EGFP，分別膠回收pre-S2基因片段及酶切后的pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α以獲得pcDNA3.1-PreS2-EGFP。⑵pre-S2在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá):pcDNA3.1-PreS2-EGFP轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48h后，經(jīng)4'，6-

3、二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。2.pre-S2對(duì)LYPLA-1啟動(dòng)子的反式激活作用應(yīng)用LYPLA-1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-LYPLA-1和pre-S2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-pre-S2共轉(zhuǎn)染HepG2，然后通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性來(lái)評(píng)價(jià)pre-S2對(duì)LYPLA-1基因啟動(dòng)子的作用。⑶外源性LPA對(duì)胰島

4、素分泌的影響：小鼠胰島細(xì)胞的分離純化:首先通過(guò)膽總管逆行灌注膠原酶Ⅴ溶液進(jìn)行小鼠胰腺消化，分離胰島，然后采用不連續(xù)密度梯度Ficoll離心法純化胰島細(xì)胞；外源性LPA對(duì)胰島細(xì)胞胰島素分泌的影響:以0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L和5μmol/L濃度LPA刺激原代培養(yǎng)的胰島細(xì)胞和分泌胰島素細(xì)胞MIN6，以培養(yǎng)液總蛋白濃度校正胰島素分泌量測(cè)定胰島素濃度。
　　結(jié)果：重組載體pcDNA3.1

5、-PreS2-EGFP測(cè)序結(jié)果證實(shí)其包含HBVpre-S2基因序列，經(jīng)亞克隆后酶切及測(cè)序均證實(shí)構(gòu)建的重組載體與設(shè)計(jì)一致。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，pEGFP-preS2轉(zhuǎn)染后可介導(dǎo)pre-S2-EGFP融合蛋白表達(dá)且綠色熒光明顯集中在細(xì)胞核內(nèi)。HBV pre-S2激活LYPLA-1基因啟動(dòng)子。外援性LPA在0-3μmol/L濃度范圍內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞的胰島素分泌。
　　結(jié)論：HBVpre-S2可定位于細(xì)胞核并激活能水解LPA的LYPLA-1