TGFBI及其R124位突變體的構(gòu)建及在角膜營(yíng)養(yǎng)不良分子發(fā)病機(jī)制方面的應(yīng)用.pdf

1、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文TGFBI及其R124位突變體的構(gòu)建及在角膜營(yíng)養(yǎng)不良分子發(fā)病機(jī)制方面的應(yīng)用姓名：牛靜宜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：王宜強(qiáng)20090420山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩十學(xué)位論文2 、用包裝細(xì)胞P T 6 7 成功包裝了病毒載體p M S C V ，并產(chǎn)生了具有侵襲能力的病毒顆粒，為下一步感染動(dòng)物做好了準(zhǔn)備。3 、p c D N A 3 ．1 - T G F B I 及其突變重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N I H 3

2、T 3 ，實(shí)時(shí)定量P C R 和w e s t e r nb l o t 結(jié)果顯示T G F B I 在N I H 3 T 3 細(xì)胞中基因和蛋白水平表達(dá)都明顯增強(qiáng)，說(shuō)明載體的構(gòu)建是成功的，可以J 下確表達(dá)。4 、p c D N A 3 ．1 ．T G F B I 及其突變重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠上皮細(xì)胞T K E 2 后，檢測(cè)到T G F B I 蛋白表達(dá)無(wú)明顯增強(qiáng)，可能與轉(zhuǎn)染效率不高有關(guān)。進(jìn)一步用包裝的p M S C V 病毒顆粒感染

3、T K E 2 ，發(fā)現(xiàn)感染效率很高，但是細(xì)胞形態(tài)改變很大，考慮改用小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞。5 、p c D N A 3 ．1 ．T G F B I 及其突變重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠基質(zhì)細(xì)胞后，r e a lt i m eP C R 檢測(cè)到T G F B I 及突變基因表達(dá)明顯增加，并且檢測(cè)到胞外基質(zhì)蛋白( e x t r a c e l l u l a r m a t r i xp r o t e i n ) e e m l 及晶體蛋白基因(

4、 c r y s t a l l i n e ) c r y a a 、c r y b a l 、c r y b b 2 表達(dá)增加，同時(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶( m a t r i x m e t a l l o p r e o t e i n a s e s m m p s ) r o m p 3 、m m p l 3 表達(dá)增加而同時(shí)其抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑( t i s s u ei n h i b i t o ro f m e t

5、 a l l o p r o t e i n a s e st i m p s ) t i m p 3及角膜基質(zhì)重塑相關(guān)基因( m a t r i x ．r e m o d e l l i n g a s s o c i a t e d7 ) m x r a 7 表達(dá)減少。結(jié)論：成功構(gòu)建了小鼠T G F B I 及其R 1 2 4 突變體的真核表達(dá)載體p c D N A 3 ．1 和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體p M S C V ，將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用