LMNA相關(guān)肌營養(yǎng)不良患兒的表型-基因型分析及LMNA突變體功能研究.pdf

1、目的:分析兒童早期起病的LMNA相關(guān)肌營養(yǎng)不良(LMNA related muscular dystrophy)患兒的病例資料,了解中國患者的臨床表現(xiàn)、肌肉病理改變特點,進(jìn)一步行基因檢測分析遺傳學(xué)特點,探討表型與基因型的關(guān)聯(lián)性,并進(jìn)行部分LMNA突變體功能研究,初步探討其可能的致病機(jī)制。
　　方法:參考文獻(xiàn)報道,對符合LMNA相關(guān)肌營養(yǎng)不良診斷標(biāo)準(zhǔn)的病例進(jìn)行臨床診斷并納入研究,共收集17例。對先證者進(jìn)行肌活檢者行常規(guī)組織學(xué)染色,并

2、電鏡觀察肌纖維超微結(jié)構(gòu)的改變。提取先證者及其父母外周血基因組DNA, PCR擴(kuò)增LMNA的12個外顯子,以瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物,PCR產(chǎn)物純化后DNA直接測序,確定基因突變的類型。部分患者同時提取外周血總RNA,行逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR的模板,并從剪切突變的兩端設(shè)計引物觀察剪切突變在RNA水平造成的改變

3、。通過特異抗體進(jìn)行培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞免疫熒光染色及構(gòu)建4種真核表達(dá)突變體進(jìn)行核纖層蛋白A/C的體外表達(dá)及亞細(xì)胞定位等功能研究。
　　結(jié)果:
　　1、臨床表型特點:17例均符合LMNA相關(guān)肌營養(yǎng)不良的臨床診斷,其中11例診斷為LMNA-相關(guān)的先天性肌營養(yǎng)不良(LMNA-related congenital muscular dystrophy, L-CMD)、6例常染色體顯性遺傳的Emery-Dreifuss肌營養(yǎng)不良(Em

4、ery-Dreifuss muscular dystrophy,EDMD)。診斷為L-CMD的病例主要表現(xiàn)為新生兒至嬰幼兒期起病的迅速進(jìn)展的軀干及頸軸肌無力,豎頭無力,由遠(yuǎn)端至近端進(jìn)展的關(guān)節(jié)攣縮,脊柱畸形,肌張力減低、腱反射減弱或消失;診斷為EDMD的病例主要表現(xiàn)為1-5歲發(fā)病的緩慢進(jìn)展的肩胛腓骨肌無力及肌萎縮,由近端至遠(yuǎn)端進(jìn)展的關(guān)節(jié)攣縮,脊柱畸形,肌張力減低、腱反射減弱或消失。兩者血清肌酸激酶( creatine kinase, CK

5、)均輕至中度升高,肌電圖(electromyogram,EMG)呈肌源性損害,心電圖可提示心律失常,頭顱磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)正常。
　　2、肌肉病理特點:17例患兒中12例行腓腸肌活檢,進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)染色及酶組織化學(xué)染色,通過電鏡觀察肌纖維超微結(jié)構(gòu)。蘇木精-伊紅(Hema-toxylin and Eosin,HE)染色等提示為肌營養(yǎng)不良改變或肌肉病樣改變,起病早的L-CMD可見

6、大量炎癥細(xì)胞浸潤。電鏡下顯示局灶或大片肌絲破壞、肌節(jié)模糊、肌纖維內(nèi)大量空泡,大量脂肪結(jié)締組織結(jié)構(gòu),肌細(xì)胞核形態(tài)異常、異染色質(zhì)濃縮,核膜局灶缺失,可見核帶、核仁裂,核周線粒集聚。
　　3、基因型:17例患兒均行致病基因LMNA突變篩查并基因確診,所有突變均為雜合突變,包括13例錯義突變、3例缺失突變及1例剪切突變。本研究共發(fā)現(xiàn)16種致病突變,其中8種為未報道的突變。14例已完成突變來源驗證,其中1例突變來自父親、13例為新生突變。c

7、.91G>A、c.94_96delAAG、c.116A>G、c.745C>T、c.746G>A、c.832G>C、c.1124C>G、c.1580G>C等突變與LMNA相關(guān)肌營養(yǎng)不良關(guān)系密切。
　　4、LMNA突變對核纖層蛋白A/C功能的影響:對1例進(jìn)行皮膚成纖維細(xì)胞免疫熒光染色,結(jié)果顯示細(xì)胞核大小和形態(tài)異常,核纖層蛋白A/C蛋白在細(xì)胞核內(nèi)有表達(dá),但分布不均勻。野生型及突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,熒光顯微鏡下顯示突變體的核纖層蛋白A/C在細(xì)

8、胞核內(nèi)分布異常。
　　結(jié)論:
　　1、17例LMNA相關(guān)肌營養(yǎng)不良患兒的臨床癥狀符合EDMD或L-CMD臨床表現(xiàn),肌肉病理提示肌營養(yǎng)不良改變或肌肉病樣改變,起病早的L-CMD可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。電鏡下可見大量肌纖維結(jié)構(gòu)破壞,肌細(xì)胞核形態(tài)異常。
　　2、本研究發(fā)現(xiàn)的突變均為雜合突變,大部分為新生突變,符合該組疾病基因突變特點,共發(fā)現(xiàn)了8種新突變。其中c.91G>A、c.94_96delAAG、c.116A>G、c.74