家蠶淡墨突變體(bd)雌性不育的分子機制研究.pdf

1、強大的生殖能力是昆蟲繁衍生息的重要基礎，而卵子發(fā)生（Oogenesis）作為昆蟲生殖的重要環(huán)節(jié)，是發(fā)育生物學研究的熱點。卵子發(fā)生為后期的胚胎發(fā)育提供了重要基礎：其中卵母細胞進行減數(shù)分裂形成雌原核為受精提供了配子；卵母細胞吸收并儲存的卵黃原蛋白為受精后胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)；而卵室進行形態(tài)構建形成的卵子為胚胎發(fā)育提供了場所。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲的卵子發(fā)生涉及復雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡，對該過程進行分子水平的研究，能進一步理解生殖及胚胎發(fā)育的遺傳基礎，也為

2、探究昆蟲繁衍與進化提供線索。家蠶是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟昆蟲，并具有重要的歷史和文化價值。自20世紀初期以來，經(jīng)歷數(shù)代人的收集保存、誘變創(chuàng)造，積累了豐富的家蠶突變體，為生物學研究提供了良好的資源。隨著家蠶基因組數(shù)據(jù)的公布以及長期的生物學關注，其被作為鱗翅目的模式昆蟲，為鱗翅目昆蟲的生物學研究提供參考。本研究以家蠶雌不育突變體淡墨（black dilute, bd）為材料，淡墨突變體具有幼蟲體壁黑化和雌蛾不育的雙重表型。在本小組先前的研究中，通過

3、定位克隆與功能驗證等手段鑒定了該突變體的突變基因是一個編碼BTB-ZF類型的轉錄因子，Bmbd。在本研究中，我們通過一系列表型分析鑒定了bd突變體是一個卵子發(fā)生異常的突變體，同時分析其雌性不育的原因和發(fā)生缺陷的關鍵時期；隨后通過對Bmbd基因從分子生物學、生物信息學和細胞生物學等水平進行分析，探究其如何影響家蠶bd突變體卵子發(fā)生。對家蠶中與卵子發(fā)生相關突變體的研究，能為鱗翅目昆蟲雌性生殖發(fā)育及卵子發(fā)生的調(diào)控機制研究提供參考，同時也為鱗翅

4、目害蟲防治提供潛在靶標。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴對野生型和家蠶bd突變體雌性內(nèi)生殖發(fā)育、卵子發(fā)生和交配受精等生物學過程進行比較分析探究不育的發(fā)生原因。通過解剖雌性內(nèi)生殖系統(tǒng)和卵巢管 DAPI染色觀察，bd突變體生殖系統(tǒng)發(fā)育、卵子發(fā)生過程與對照相比沒有觀察到顯著差異；結合掃描電鏡與受精卵DNA染色觀察，發(fā)現(xiàn)bd突變體卵孔孔道異常導致精子不能正常進入卵中；人工孤雌生殖實驗表明bd突變體卵存在發(fā)育潛能缺陷。綜上所述，卵孔孔道異常與卵

5、存在發(fā)育潛能缺陷是 bd突變體不育發(fā)生的主要因素。其中，卵孔孔道形成與卵室內(nèi)邊界細胞的形成與遷移相關，在bd突變體中卵孔孔道異?？赡苁沁吔缂毎漠惓Ｐ纬苫蜻w移所致。⑵Bmbd基因作為家蠶bd突變體的突變基因，我們分別對家蠶卵巢及卵巢管中不同發(fā)育時期的卵室進行取材，通過熒光定量PCR方法和原位雜交實驗檢測Bmbd基因在卵巢發(fā)育與卵子發(fā)生過程中的表達情況，分析其在家蠶卵子發(fā)生過程中可能的作用時間與部位。熒光定量PCR結果表明Bmbd基因在家

6、蠶生殖細胞分化關鍵時期（4齡眠前后）和卵子發(fā)生過程中卵室成熟發(fā)育階段（5齡早期和上簇至化蛹期）具有相對較高的表達水平；進一步通過原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)其在卵子發(fā)生過程早期具有較高表達，且表達主要集中在濾泡細胞中。⑶分別對Bmbd基因轉錄起始上游區(qū)域進行轉錄因子結合位點分析、通過bd突變體轉錄組數(shù)據(jù)篩查選取潛在的下游基因進行分析，鑒定Bmbd基因上下游可能相互作用的基因。通過genomatix網(wǎng)站預測分析發(fā)現(xiàn)Bmbd基因上游存在與邊界細胞形成與

7、遷移密切相關的STAT和slow border cells兩個轉錄因子的結合位點。通過對轉錄組數(shù)據(jù)篩查選取了與卵子發(fā)生相關的 Bmovo-1基因和與染色質(zhì)形成相關的BmHp1b-l基因，對這兩個基因在野生型中的表達模式進行分析并選取關鍵表達時期檢測其在bd突變體中的表達情況。結果顯示，相對于野生型，這兩個基因在bd突變體中均具有顯著表達差異，分析發(fā)現(xiàn)這兩個基因均可能作為Bmbd基因的下游靶基因參與影響家蠶bd突變體生殖異常的發(fā)生。并進一

8、步推測，bd突變體中Bmbd基因的功能缺陷，可能引起邊界細胞形成或遷移異常，從而引起卵孔結構破壞，同時該基因的缺陷可能導致下游Bmovo-1和BmHp1b-l基因表達水平改變，造成不育的發(fā)生。⑷通過構建細胞表達載體對Bmbd基因兩種剪切形式進行核定位分析，結果發(fā)現(xiàn)Bmbd-1主要集中在細胞質(zhì)中表達，而Bmbd-2集中于細胞核周圍與細胞核中表達，兩種剪切形式所編碼的蛋白核定位的差異暗示著其具有不同的作用方式。通過構建Bmbd基因在細胞中的

9、過表達載體以及合成dsRNA，在家蠶卵巢細胞系中分別過表達和干涉Bmbd基因，結果發(fā)現(xiàn)Bmbd基因表達下調(diào)會引起家蠶卵巢細胞的遷移受阻，這進一步驗證了Bmbd基因在邊界細胞遷移過程中起重要作用。Bmbd基因編碼具有BTB結構域的蛋白，而包含BTB功能域的蛋白可結合其他蛋白形成蛋白復合體進行作用，我們通過免疫共沉淀實驗鑒定了Bmbd-1蛋白能與邊界細胞遷移相關的重要蛋白Actin和Ral-a結合。本部分我們在細胞水平證實Bmbd基因會影響