CK2α在肺癌中凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、目的：⑴確定CK2α在肺癌組織及癌旁肺組織中的表達(dá)特性。⑵構(gòu)建與綠色熒光蛋白融合表達(dá)的pSilencerTM4.1/shCK2α慢病毒干擾載體，建立穩(wěn)定干擾CK2α的肺癌細(xì)胞株A549。⑶探討干擾CK2α對肺癌細(xì)胞株A549生物學(xué)特性的影響，從整體上研究CK2α在肺癌中的凋亡機(jī)制，為進(jìn)一步研究CK2α對肺癌可能的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法：①采用免疫組織化學(xué)SP法和Western blot檢測CK2α在臨床肺癌組織標(biāo)本及

2、癌旁肺組織中的表達(dá)，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②利用針對CK2α基因設(shè)計的shRNA序列，獲得CK2α干擾片段，構(gòu)建與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)融合表達(dá)的CK2α慢病毒載體，將慢病毒載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝慢病毒，收集病毒上清液，進(jìn)行病毒滴度測定，將含CK2α特異干擾片段的慢病毒感染A549細(xì)胞，以空載體的病毒為陰性對照，利用GFP的表達(dá)用流式細(xì)胞儀篩選出兩株穩(wěn)定干擾CK2α基因的

3、肺癌細(xì)胞株。命名為實(shí)驗(yàn)組（分別縮寫為sh870、sh1028）;對照細(xì)胞株命名為病毒空白對照組（縮寫為NC）;同時以未做任何處理的肺癌A549細(xì)胞命名為陰性對照組(縮寫為Con)。利用RT-PCR法檢測CK2α在干擾前后mRNA的變化;Western blot法檢測干擾前后CK2α蛋白表達(dá)的情況。③MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測CK2α干擾后對肺癌細(xì)胞體外增殖能力的影響;④流式細(xì)胞儀和TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測CK2α干擾后對肺癌細(xì)胞凋亡能力的影

4、響;⑤Transwell及Boyden小室檢測CK2α干擾后對肺癌細(xì)胞體外遷移運(yùn)動及侵襲能力的影響;⑥Western blot檢測CK2α干擾后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3、Caspase-8、Akt、Bcl-2)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：⑴CK2α在肺癌組織中高表達(dá)，在癌旁肺組織中低表達(dá)。⑵慢病毒載體pSilencerTM4.1/shCK2α的構(gòu)建及鑒定，并感染肺癌細(xì)胞株A549 PCR和測序證實(shí)，成功構(gòu)建了CK2α sh

5、RNA的慢病毒載體pSilencerTM4.1/shCK2α。包裝慢病毒，并測得病毒滴度為3.4×108 TU/ml。慢病毒感染A549細(xì)胞，然后分選鑒定GFP+細(xì)胞，Real time RT-PCR和Western blot鑒定干擾后效率，建立了穩(wěn)定干擾CK2α的肺癌細(xì)胞株A549。Real time RT-PCR結(jié)果顯示:sh870(0.0007780±0.0005470)、sh1028組(0.0002980±0.0001204)

6、CK2α mRNA的表達(dá)水平顯著低于Con組(0.007258±0.0002271)、NC組(0.007261±0.0011242)，均P=0.000。Western blot結(jié)果顯示:sh870(0.703848±0.007816)、sh1028組(0.550648±0.010588)CK2α蛋白的表達(dá)水平顯著低于Con組(1.313444±0.059472)、NC組(1.084371±0.024494)，均P=0.000。⑶MTT結(jié)

7、果顯示:隨著培養(yǎng)時間的延長，sh870、sh1028組細(xì)胞生長速度明顯慢于Con和NC組（P＜0.05）。⑷平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:sh870(15.67±0.577)、sh1028組(13.33±0.557)克隆形成率明顯少于Con(68.33±1.528)和NC組(68.67±3.055)(F=894.009，P＜0.001)。綜上所述，干擾CK2α后抑制了肺癌細(xì)胞體外增殖能力。⑸流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:sh870(27.867±4.

8、818)、sh1028組(29.867±4.588)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于Con組(3.000±1.058)和NC(2.667±1.320)（F=57.695，P＜0.001）。⑹TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:sh870(7.67±1.155)、sh1028組(7.67±2.082)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于Con組(1.27±0.462)和NC組(1.67±1.155)(F=21.360，P＜0.001)。⑺Transwell遷移運(yùn)動實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:sh

9、870(88.33±6.807)、sh1028組(96.00±10.817)穿過底膜的細(xì)胞明顯少于Con組(333.67±31.565)和NC組(334.00±31.00)(F=110.215, P＜0.001)。⑻Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:sh870(62.00±6.000)、sh1028組(61.33±5.686)穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯少于Con組(134.67±10.066)和NC組(134.67±7.638)(F=93.

10、495，P＜0.001)。綜上所述，干擾CK2α后顯著降低了肺癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。⑼Western blot結(jié)果顯示:sh870、sh1028組Caspase-3（F=28.076，P＜0.01）、Caspase-8（F=35.233，P＜0.01）蛋白的表達(dá)水平顯著高于Con和NC組;而sh870、sh1028組Akt(F=25.866，P＜0.01)、Bcl-2（F=22.103，P＜0.01）蛋白的表達(dá)水平明顯低于Con和

11、NC組;而sh870和sh1028組，Con和NC組在4種蛋白中的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：①CK2α在肺癌中表達(dá)上調(diào)。②成功構(gòu)建了pSilencerTM4.1/CK2α慢病毒干擾載體;轉(zhuǎn)染后，建立了穩(wěn)定干擾CK2α基因表達(dá)的肺癌細(xì)胞株A549。③干擾CK2α基因表達(dá)后促進(jìn)了A549細(xì)胞的凋亡能力;抑制了A549細(xì)胞的增殖、體外遷移運(yùn)動及侵襲能力;CK2α在肺癌中通過調(diào)控Caspase-3、Caspase-8