豬乳鐵蛋白工程菌發(fā)酵技術(shù)參數(shù)研究.pdf

1、乳鐵蛋白是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物外分泌液中的多功能糖蛋白,它具有殺菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等多種生物學(xué)功能。本文研究內(nèi)容是在本課題組前期成功完成豬乳鐵蛋白基因在畢赤嗜甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建的基礎(chǔ)上,結(jié)合現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù),對所構(gòu)建重組菌株的發(fā)酵工藝和發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物作用效果進(jìn)行了研究。取得的主要結(jié)果如下:
　　1.試驗(yàn)研究了重組豬乳鐵蛋白菌株在種子培養(yǎng)基中的生長代謝規(guī)律。在發(fā)酵培養(yǎng)的20h內(nèi)經(jīng)歷了延遲期、對數(shù)生長期、減速

2、期和靜止期,試驗(yàn)將重組菌株的對數(shù)生長期中期時(shí)間(13h)確定為最佳接種種齡時(shí)間并用于后期試驗(yàn)。試驗(yàn)研究了重組菌株在甲醇誘導(dǎo)作用下,目的蛋白在168h內(nèi)的表達(dá)量的變化規(guī)律。目的蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,誘導(dǎo)發(fā)酵144h后達(dá)到表達(dá)量最高點(diǎn),試驗(yàn)將144h設(shè)定為效價(jià)分析檢測點(diǎn)和誘導(dǎo)發(fā)酵周期。
　　2.在搖瓶發(fā)酵環(huán)境中通過單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì):改變發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中一種營養(yǎng)成分的種類或用量,其它營養(yǎng)成分種類和用量不變。

3、通過單因素試驗(yàn)篩選出了最佳的碳源、氮源、碳源添加量、C/N。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,試驗(yàn)設(shè)計(jì)了L16(45)正交優(yōu)化試驗(yàn),通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)篩選出了最適重組菌株蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)基。此外,試驗(yàn)還對影響重組菌株蛋白表達(dá)的相關(guān)因素(初始pH值、接種量)進(jìn)行了選擇性優(yōu)化,確定了搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件。搖瓶發(fā)酵的最適合培養(yǎng)基及其添加量:最佳碳源馬鈴薯淀粉(40g/L)、最佳氮源豆粕(8g/L)、生物素4mL/L(4×10-5％)、MgS04.7H20添加

4、量為5g/L和KH2P04添加量3g/L。在250ml三角瓶中裝入50ml培養(yǎng)基,發(fā)酵溫度為30℃、搖床轉(zhuǎn)速為250 r.min-1的條件下,發(fā)酵初始pH值為4.5、發(fā)酵后期pH值為5.0,種子培養(yǎng)液的接種量為4%的條件下,對搖瓶發(fā)酵環(huán)境中目的蛋白表達(dá)最為適宜。在此發(fā)酵條件下經(jīng)反相高效液相色譜檢測,重組菌株目的蛋白表達(dá)量達(dá)55.5μg/mL(檢測樣品經(jīng)1/4倍體積濃縮)。
　　3.在搖瓶發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上,試驗(yàn)利用10L發(fā)酵罐對重組

5、菌株進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)。通過搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)篩選得出的培養(yǎng)基,在初步的發(fā)酵罐放大試驗(yàn)中得到應(yīng)用,試驗(yàn)菌株可以穩(wěn)定地利用其進(jìn)行生長和產(chǎn)物表達(dá)。試驗(yàn)利用10L發(fā)酵罐研究了影響重組菌株生長和目的蛋白表達(dá)的發(fā)酵工藝參數(shù),通過分批發(fā)酵,選擇性地研究了機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速、初始pH值和溫度,對發(fā)酵過程中重組菌株菌體生長和目的蛋白表達(dá)的影響,試驗(yàn)研究確定了重組菌株在10L發(fā)酵罐中的相關(guān)發(fā)酵工藝參數(shù)。試驗(yàn)研究了不同的甲醇添加方式對試驗(yàn)菌株生長和目的蛋白表達(dá)量的影響,

6、確定了最佳的補(bǔ)料方式。試驗(yàn)菌株在10L發(fā)酵罐中最佳發(fā)酵參數(shù):機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速為300-350 r.min-1,采用分段控制策略;發(fā)酵初始pH值為4.8;發(fā)酵溫度為28-30℃,采用分段控制策略;通氣比為1.0vvm。發(fā)酵24h后,每12h向發(fā)酵罐中補(bǔ)充一定濃度的甲醇用于試驗(yàn)菌株目的蛋白誘導(dǎo)。在發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化后的10L發(fā)酵罐中,經(jīng)檢測重組菌株目的蛋白表達(dá)量達(dá)604.4μg/mL(檢測樣品經(jīng)1/4倍體積濃縮)。
　　4.通過薄層瓊脂糖孔

7、穴擴(kuò)散試驗(yàn)和時(shí)間動(dòng)態(tài)曲線試驗(yàn)對重組菌株發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物抗菌效果進(jìn)行研究。薄層瓊脂糖孔穴擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果直觀的顯示了,重組發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌E.coli K88的生長有顯著的抑制作用,且抑制作用效果與重組目的蛋白試驗(yàn)量存在直接的關(guān)系。時(shí)間動(dòng)態(tài)曲線試驗(yàn)進(jìn)一步從動(dòng)態(tài)的角度證實(shí),重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物對豬霍亂沙門氏菌和鼠傷害沙門氏菌的生長均具有抑制、殺滅作用。本文研究內(nèi)容是以產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用為立足點(diǎn),在搖瓶發(fā)酵環(huán)境中篩選出適合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)使用的培養(yǎng)基配方,在