豬乳鐵蛋白基因克隆及在p.methanolica表達系統(tǒng)中的表達及其產(chǎn)物的抑菌活性研究

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文豬乳鐵蛋白基因克隆及在P.methanolica表達系統(tǒng)中的表達及其產(chǎn)物的抑菌活性研究姓名：劉光富申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)指導(dǎo)教師：汪以真20050501浙江人學(xué)壩l j 學(xué)位論史C l o n e a n dE x p r e s s i o no fR e c o m b i n a n t P o r c i n e L a c t o f e r r i ni nP i c h i am e

2、 t h a n o l i c a E x p r e s s i o nS y s t e ma n d I t sA n t i m i c r o b i a lA c t i v i t yL a c t o f e r r i n ( L F ) i sa m u l t i f u n c t i o n a l g l y c o l p r o t e i ni n p h y s i o l o g i c a l

3、f l u i d s o fm a m m a l s ，S e v e r a l f u n c t i o n s h a v eb e e np r o p o s e df o rl a c t o f e r r i n ，i n c l u d i n gp r o t e c t i o na g a i n s t m i c r o b i a l i n f e c t i o n ，r e g u l a t

4、i o n o f i m m u n e f u n c t i o n ，r e g u l a t i o n o fm y e l o p o i e s i s ，c e l l u l a rg r o w t hp r o m o t i o n ，r e g u l a t i o no f i n t e s t i n a li r o na b s o r p t i o na n dr e g u l a t i

5、 o no ft r a n s c r i p t i o n ．I nt h i s s t u d y , p o r c i n el a c t o f e r r i ng e n ew a s c l o n e d f r o mm a m m a r yg l a n d c e l l s o f l a c t a t i n g s o w , a n de x p r e s s e db y u s i n

6、gE ．c o B a n d 尸m e t h a n o l i c ae x p r e s s i o n s y s t e m ．A n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o fr e c o m b i r T a n t e x p r e s s i o np r o d u c t sw a s s t u d i e d ．T h er e s u l t sw e r e

7、s u m m a r i z e d a sf o l l o w s ：T o t a lR N A i n m a m m a r yg l a n dc e l l so f1 5 一d a yl a c t a t i n gY o r k s h i r eS O W w a se x t r a c t e da n dP L F g e n ew a sc l o n e db yt h er e v e r s e t

8、 r a n s c r i p t i o n —c o u p l e dp o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( R T - P C R ) ．T h i sg e n ec o n t a i n sa 2 1 1 2 b pc o d i n gs e q u e n c e ( c d s ) o f P L ET h e s e q u e n c i n g r e s

9、 u l t s w e r e a l i g n e d w i t h t h e s e q u e n c e ( G e n e b a n k ，L 7 7 8 8 7 ) ，i n d i c a t i n gt h a t t h eh o m o l o g yb e t w e e n t h e s et w os e q u e n c e s w a s9 9 ％a n ds h o w e dt h ep

10、 o r c i n e l a c t o f e r r i n g e n e w a s c o r r e c t l y c l o n e d ．T h eg e n e w a sc l o n e d i n t o E ．c o l ie x p r e s s i o nv e c t o rp E T - 3 0 a ( + ) a n dt r a n s f o r m e d i n t oE ．c o l

11、 iB L 2 1 D E 3 ．T h ee x p r e s s i o nw a si n d u c e dw i t h I P T G R e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sa n a l y z e d w i t h S D S —P A G Ea n dW e s t e r nB l o t ．B o t hr e s u l t ss h o w e dt h a t t

12、h er P L Fw a s w e l le x p r e s s e d i n E ．c o l ia n dm o l e c u l a r w e i g h t ( M 聊o f t h e r e s o m b i n a n t p r o d u c t w a s e x t i m a t e d t o b ea p p r o x i m a t e l y 7 8 k D a ．w h i c hw

13、a s c o i n c i d i n gw i t hp r e d i c t e dM W o f r P L F ．I no r d e r t oe x p r e s s t h eP L F i n y e a s t ．T w on e w p r i m e r s w e r ed e s i g n e d ．U s i n g t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp

14、G E M —P L F a s t e m p l a t e ，P L Fg e n e w a sa m p l i f i e d a g a i na n ds u b s e q u e n t l yc l o n e di n t oP m e t h a n o l i c a e x p r e s s i o nv e c t o rP M E T - B ．D N A s e q u e n c i n gr e