維生素C兩步發(fā)酵中關(guān)鍵步驟的分子生物學(xué)研究.pdf

1、在維生素C兩步發(fā)酵工藝中，第一步為醇糖轉(zhuǎn)化，即在葡糖桿菌作用下D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖；第二步為糖酸轉(zhuǎn)化，在普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigeniumvulgare，俗稱小菌)與其伴生菌(俗稱大菌)組成的混合菌系的作用下L-山梨糖轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸(KGA)。維生素C兩步發(fā)酵實質(zhì)上就是D-山梨醇和L-山梨糖的專一性生物氧化過程。闡明這一系列生物氧化過程的生化反應(yīng)機(jī)制對于指導(dǎo)維生素C的遺傳育種甚至通過代謝

2、工程構(gòu)建由山梨醇到KGA的一步發(fā)酵工程菌，都具有重要意義。 本課題組已從小菌細(xì)胞裂解物中分離得到了催化山梨糖生物氧化的一種關(guān)鍵酶——山梨糖脫氫酶(SDH)，該酶能夠?qū)-山梨糖直接轉(zhuǎn)化為KGA；同時構(gòu)建了小菌的基因文庫，并以SDH的抗體篩選文庫，分離得到編碼SDH的基因(sdh)。 本文在上述工作基礎(chǔ)上，首先在大腸桿菌中對山梨糖脫氫酶進(jìn)行了高效表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，研究了該酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值、酶穩(wěn)定性

3、、米氏反應(yīng)常數(shù)、酶的激活劑和抑制劑、金屬離子的激活與抑制作用等重要性質(zhì)。 研究葡糖桿菌對山梨糖脫氫酶的影響。以氨甲?；富?hyuC)為報告基因，構(gòu)建了山梨糖脫氫酶-氨甲?；溉诤媳磉_(dá)載體，在大腸桿菌中可以同時檢測到山梨糖脫氫酶和氨甲酰化酶活性；而在葡糖桿菌中，只能檢測到氨甲?；富钚?，未檢測到山梨糖脫氫酶活性。質(zhì)粒穩(wěn)定性實驗和質(zhì)?；剞D(zhuǎn)實驗說明該質(zhì)粒在葡糖桿菌中穩(wěn)定存在。由于hyuC基因位于sdh基因下游，融合基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯

4、是從山梨糖脫氫酶到氨甲酰化酶，氨甲?；冈谄咸菞U菌中表達(dá)說明包含山梨糖脫氫酶在內(nèi)的融合蛋白能夠在葡糖桿菌中轉(zhuǎn)錄并翻譯，山梨糖脫氫酶可能被宿主的酶系降解失活。 通過體外實驗也證實葡糖桿菌裂解物對山梨糖脫氫酶具有降解作用。將山梨糖脫氫酶與葡糖桿菌裂解液保溫過夜后，通過SDS-PAGE檢測到電泳圖譜上約60kD和49kD處出現(xiàn)兩條明顯條帶，對這兩條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)N-端序列分析，結(jié)果顯示其N端的前3個氨基酸殘基均為谷氨酰胺-蘇氨酸-丙氨酸

5、，推測49kD的蛋白條帶是由60kD山梨糖脫氫酶蛋白C-端降解產(chǎn)生。對預(yù)測的sdh讀框N-端蛋氨酸至谷氨酰胺之間23肽氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)23個氨基酸中大部分氨基酸為疏水氨基酸，并與醇脫氫酶的信號肽序列有38％的同源性，推測山梨糖脫氫酶N-端的23肽可能是一段信號肽，與該酶在細(xì)胞膜上的定位相關(guān)。 本文成功建立了葡糖桿菌Tn5誘變系統(tǒng)，實現(xiàn)了mini-Tn5轉(zhuǎn)座對葡糖桿菌的誘變，并從1032株突變株中篩選得到能夠利用山梨醇而不能利