產(chǎn)紫杉醇紅豆杉內(nèi)生真菌的分離和遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、紫杉醇是一種高效、廣譜的天然抗癌藥物,是經(jīng)FDA認(rèn)證的當(dāng)今最好的抗癌藥物之一,它最早是在紅豆杉樹皮中發(fā)現(xiàn)的一種植物次生代謝產(chǎn)物,目前紫杉醇主要是從紅豆杉樹皮和針葉中提取。但由于紅豆杉是世界珍稀物種,生長緩慢,其紫杉醇含量很低,造成紫杉醇價格昂貴。隨著產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌的不斷被發(fā)現(xiàn),以紫杉醇產(chǎn)生菌為藥源,通過微生物發(fā)酵工藝生產(chǎn)紫杉醇成為了一個新的研究熱點,一旦獲得成功將是解決藥源短缺的有效途徑之一。
　　本研究從野生南方紅豆杉(Ta

2、xus chinensis var.mairei)的不同組織中分離到了38株內(nèi)生真菌,通過LC-MS檢測發(fā)現(xiàn)了三株產(chǎn)紫杉醇及其前體化合物的內(nèi)生真菌,分別命名為EFY-20、EFY-21和EFY-36。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定,這些真菌分別屬于鏈格孢屬(Alternana sp.)、束絲菌屬(Ozonium sp.)和毛霉屬(Mucorsp.)。體外細(xì)胞毒性實驗證實了其抗癌活性。以分離到的紫杉醇產(chǎn)生菌為材料,同源克隆到了紅豆杉紫杉醇合成途徑關(guān)鍵酶紫杉

3、二烯合成酶基因fs的632 bp核心片段,通過和其宿主南方紅豆杉Fs基因的對比發(fā)現(xiàn),兩者具有很高的同源性。此外,對分離到的全部38株內(nèi)生真菌進(jìn)行Fs核心片段的PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)PCR陽性的菌株有更大的產(chǎn)生紫杉醇的機(jī)率,由此建立了基于PCR技術(shù)的紫杉醇產(chǎn)生菌的快速篩選方法。
　　以產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌EFY-21為材料進(jìn)行了生長曲線的測定以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化,并進(jìn)行了原生質(zhì)體制備研究,通過酶組合、酶解溫度、酶解時間、菌齡等多個制備條件的優(yōu)化

4、,使原生質(zhì)體產(chǎn)率達(dá)到7.17±0.40x107/ml,測定結(jié)果表明,所制備的原生質(zhì)體活力良好,再生率達(dá)到6.52±0.25％。良好的原生質(zhì)體制備體系的建立為利用原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化、融合及誘變等生物技術(shù)研究紫杉醇產(chǎn)生菌奠定了基礎(chǔ)。
　　在原生質(zhì)體制備的基礎(chǔ)上進(jìn)行了PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,通過抗生素潮霉素篩選成功獲得了轉(zhuǎn)化子,并評價了PEG濃度、Ca2+濃度、轉(zhuǎn)化后潮霉素添加時間等多個因素對轉(zhuǎn)化效率的影響,使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到2-16±0.27/

5、Pg DNA。通過PCR和Southern blot檢測,確認(rèn)了外源基因在內(nèi)生真菌基因組中的整合。
　　此外,還構(gòu)建了帶有紅豆杉紫杉二烯合成酶基因ts的真菌表達(dá)載體:Pv2+-TS-Pan7-1,該載體帶有兩個表達(dá)盒,分別由frpC和gbdA真菌啟動子啟動ts和潮霉素抗性基因的表達(dá)。利用該載體進(jìn)行了EFY-21的遺傳轉(zhuǎn)化,對獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了PCR及Southern blot驗證,并通過LC-MS測定了紫杉醇含量的變化,最終篩選到