紅豆杉產(chǎn)紫杉烷類物質(zhì)內(nèi)生真菌的篩選及其發(fā)酵工藝過程檢測與優(yōu)化.pdf

1、紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）是從紅豆杉屬（Taxusspp.）植物中分離得到的一類新型的具有微管抑制活性的天然二萜類抗腫瘤藥物，其作用機(jī)制獨特，對癌癥的臨床適應(yīng)范圍較廣，被認(rèn)為是抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域最重大的發(fā)現(xiàn)。目前，商品化的紫杉醇及其重要半合成前體10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-DeacetylbaccatinⅢ，10-DABⅢ）主要都是從紅豆杉屬植物材料中提取，這些物質(zhì)在植物中的含量都較低。自從太平洋紫杉（短葉紅豆杉

2、T. brevifolia）的枝條中發(fā)現(xiàn)一株能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌以來，從紅豆杉植株不同生理學(xué)部位中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紫杉烷類物質(zhì)內(nèi)生真菌的研究極為迅速，國內(nèi)外相關(guān)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的研究報道較多，但仍然缺乏穩(wěn)定和高產(chǎn)的適用于工業(yè)化發(fā)酵的菌株。這些問題的解決就需要分離更高效的內(nèi)生真菌菌株，改善分析和檢測內(nèi)生真菌發(fā)酵液中紫杉醇及其類似物含量的方法，優(yōu)化發(fā)酵條件，并進(jìn)一步探尋內(nèi)生真菌發(fā)酵液中紫杉醇及其類似物的分離純化工藝。本研究主要內(nèi)容包括：
　　

3、⑴以從自然界中獲得高產(chǎn)紫杉醇菌株為目的，對不同生境下太行紅豆杉（T. chinesis）的根、莖和葉不同部位來源的內(nèi)生真菌進(jìn)行產(chǎn)紫杉醇活力篩選。從紅豆杉三個部位中共分離內(nèi)生真菌186株，根、莖和葉分別為93、67和26株；其中野生型紅豆杉內(nèi)生真菌110株，仿野生型紅豆杉內(nèi)生真菌76株。從分離內(nèi)生真菌的數(shù)量和分離效率看野生型紅豆杉根部來源的內(nèi)生真菌更為豐富。根、莖和葉來源的產(chǎn)紫杉醇菌株發(fā)酵液中紫杉醇的平均含量分別為248.57、149.0

4、9和104.94μg/L；其中最高產(chǎn)一株的含量為622.75μg/L。進(jìn)一步對產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌發(fā)酵液中紫杉醇的定性與定量檢測方法進(jìn)行了研究。采用C18固相萃取柱（SPE）對紫杉醇進(jìn)行吸附，用不同濃度的甲醇-乙酸銨和甲醇分別作為洗脫劑，之后用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相為甲醇：水：乙腈（V/V/V）=20：45：35，流速和檢測波長分別為0.70mL/min和227nm的HPLC分析條件最佳；而洗脫劑為80％甲醇

5、時洗脫能力和效果較好，紫杉醇的回收率可達(dá)到87.6%。因此，本研究建立了快速高效低耗的SPE-HPLC對內(nèi)生真菌發(fā)酵液中紫杉醇的定性與定量分析方法。論文對產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌發(fā)酵液中紫杉醇的純化工藝進(jìn)行了初步研究，采用非極性 D4020型大孔樹脂對產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行吸附和解吸附測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn) D4020型樹脂對紫杉醇有較好的吸附和分離效果。優(yōu)化工藝條件為：室溫下，樣品溶于體積分?jǐn)?shù)50%甲醇-水溶液，上柱液流量為1.5 mL/min，

6、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇-水溶液以流量0.5 mL/min洗脫，洗脫劑用量為7倍量樹脂體積，回收率可達(dá)90%。
　?、茖δ戏郊t豆杉（T. wallichiana var. mairei）中產(chǎn)10-DABⅢ內(nèi)生真菌進(jìn)行了篩選。從南方紅豆杉根皮部位分離得到了內(nèi)生真菌102株，通過HPLC和LC-MS分析，發(fā)現(xiàn)了一株木霉屬內(nèi)生真菌 Trichoderma sp. IRB54能夠產(chǎn)生10-DABⅢ，其在PDB培養(yǎng)基中的產(chǎn)量為187.56?g/L

7、。對IRB54菌株發(fā)酵液中的該色譜峰進(jìn)行了分離純化，發(fā)現(xiàn)該色譜峰與10-DABⅢ標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的1H NMR譜圖數(shù)據(jù)，進(jìn)一步證實IRB54具有產(chǎn)生10-DABⅢ的能力，為10-DABⅢ的來源提供了新的參考。論文又對內(nèi)生真菌發(fā)酵液中10-DABⅢ的快速定性與定量分析方法進(jìn)行了研究。采用薄層色譜法（TLC）不同比例的三種展開系統(tǒng)：丙酮-石油醚；正己烷-氯仿-乙酸乙酯-甲醇-三乙胺和環(huán)己烷-乙酸乙酯，研究其對10-DABⅢ展開效果的影響，再聯(lián)

8、合HPLC分析進(jìn)行檢測驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以丙酮：石油醚=4：1作為展開劑，乙醇：濃硫酸=9：1為顯色劑的檢測結(jié)果最佳，最小檢測限為0.3μg。本研究建立了TLC-HPLC快速定性與定量分析內(nèi)生真菌發(fā)酵液中10-DABⅢ的方法。論文還比較了紅豆杉枝條、紅豆杉愈傷組織、產(chǎn)10-DABⅢ菌株Trichoderma sp.IRB54單獨發(fā)酵，紅豆杉愈傷組織和紅豆杉枝條分別與Trichoderma sp.IRB54耦合發(fā)酵5種方法對10-DABⅢ產(chǎn)

9、量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種方法獲得10-DABⅢ濃度分別為274.6、154.3、189.4、887.5和684.7μg/mL，其中紅豆杉枝條和Trichoderma sp.IRB54耦合發(fā)酵濃度最高達(dá)887.5μg/mL，為產(chǎn)10-DABⅢ內(nèi)生真菌的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。
　　⑶對紫杉醇的發(fā)現(xiàn)和來源，以及產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的研究進(jìn)展進(jìn)行了文獻(xiàn)綜述。進(jìn)一步對內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)的萜類次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了綜述，一共總結(jié)了274個內(nèi)生真菌來源的萜類