南方紅豆杉內(nèi)生真菌多樣性、次生代謝產(chǎn)物及其與宿主的相關(guān)性研究.pdf

1、本課題以我國(guó)珍稀保護(hù)藥用植物南方紅豆杉內(nèi)生真菌為研究對(duì)象，對(duì)其生物多樣性及代謝產(chǎn)物和其與宿主的相關(guān)性進(jìn)行系統(tǒng)地研究，以期為開(kāi)發(fā)新的天然藥物資源和提高藥材品質(zhì)提供新的思路。
　　 與已報(bào)道的同屬植物相比，南方紅豆杉具有更加豐富的內(nèi)生真菌種類(lèi)。從3個(gè)產(chǎn)地(江西井岡山、浙江景寧、重慶縉云山)南方紅豆杉3個(gè)部位(葉片、枝條、樹(shù)皮中)共分離得到2442株內(nèi)生真菌，根據(jù)菌株群落的培養(yǎng)特征及5.8S和ITS區(qū)片段序列相似性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，

2、共鑒定為145個(gè)分類(lèi)單元(分子鑒定143個(gè)分類(lèi)單元，2個(gè)未能進(jìn)行分子鑒定的形態(tài)型)，歸屬到真菌界3個(gè)門(mén)6個(gè)綱20個(gè)目66個(gè)屬，其中125個(gè)分類(lèi)單元(占總數(shù)的86.2％)屬于子囊菌門(mén)，14個(gè)(占9.8%)屬于擔(dān)子菌門(mén)，5個(gè)(3.4%)屬于接合菌門(mén)，1個(gè)(0.7%)未確定分類(lèi)地位。南方紅豆杉內(nèi)生真菌生物多樣性及豐度受組織類(lèi)型影響顯著，枝條、樹(shù)皮中內(nèi)生真菌多樣性及豐度為葉片的1.2-3倍。
　　 地理位置、組織類(lèi)型對(duì)南方紅豆杉內(nèi)生真菌

3、組成及分布具有顯著的影響，優(yōu)勢(shì)類(lèi)群(目、屬、種水平上)存在產(chǎn)地間、部位間明顯差異。鑒定的145個(gè)分類(lèi)單元中，僅10個(gè)分類(lèi)單元為3個(gè)地點(diǎn)共有，20個(gè)分類(lèi)單元為2個(gè)地點(diǎn)共有，其他分類(lèi)單元只在1個(gè)地點(diǎn)出現(xiàn)。Hypoxylon、Pezicula、Pestalotiopsis為不同產(chǎn)地特有的優(yōu)勢(shì)屬；最優(yōu)勢(shì)目Magnaporthales、Botryosphaeriales、Glomerellales、Diaporthales、Xylariales、

4、Helotiales、Hypocreales，最優(yōu)勢(shì)屬Phyllosticta/Guignardia、Colletotrichum/Glomerella、Phomopsis、Hypocrea/Trichoderma、Pezicula的分布具有顯著的組織特異性。大多數(shù)優(yōu)勢(shì)種都表現(xiàn)出明顯的地理特異性或組織特異性，許多分離頻率低的菌還表現(xiàn)出地理專(zhuān)一性或組織專(zhuān)一性。由于產(chǎn)地和部位的作用，更多種類(lèi)的內(nèi)生真菌從南方紅豆杉中獲得。南方紅豆杉豐富多樣的

5、內(nèi)生真菌種類(lèi)是極其重要的資源寶庫(kù)，為內(nèi)生真菌后續(xù)研究工作提供了重要素材。
　　 利用高效液相色譜法測(cè)定有效成分(Taxol、10-DABⅢ)的含量，并結(jié)合南方紅豆杉相關(guān)化學(xué)成分的HPLC-TOF/MS數(shù)據(jù)分析，比較3個(gè)產(chǎn)地南方紅豆杉3個(gè)部位化學(xué)成分包括有效成分的差異。結(jié)果表明南方紅豆杉Taxol與10-DABⅢ含量存在部位間、產(chǎn)地間顯著差異。3個(gè)產(chǎn)地的南方紅豆杉的Taxol含量均以樹(shù)皮部位明顯高于枝條、葉片部分，且以江西產(chǎn)地樹(shù)皮

6、含量最高；3個(gè)產(chǎn)地的南方紅豆杉10-DABⅢ含量則均以葉片明顯高于枝條、樹(shù)皮部分，且以江西產(chǎn)地葉片中含量最高。
　　 從化學(xué)成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)初步鑒別結(jié)果來(lái)看，南方紅豆杉植物中的化學(xué)成分極為復(fù)雜，包含紫杉烷類(lèi)化合物，部分松香烷類(lèi)、木脂素類(lèi)等化合物。南方紅豆杉葉片、枝條、樹(shù)皮3個(gè)部位化學(xué)成分的差異顯著，這與內(nèi)生真菌菌群部位間的差異結(jié)果相符。通過(guò)對(duì)飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù)的PLSDA分析篩選出18個(gè)在部位間分布有明顯差異的化合物，比對(duì)確立的南方紅

7、豆杉化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)初步鑒別出11個(gè)化合物，8個(gè)紫杉烷二萜類(lèi)(P2、P5-P7、N1、N2、N7-N9)、1個(gè)松香烷二萜類(lèi)(N6)、和2個(gè)木脂素類(lèi)(N3、N5)。
　　 進(jìn)一步考察南方紅豆杉化學(xué)成分包括有效成分與內(nèi)生真菌之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)18個(gè)部位間差異化合物的量與一些具有組織特異性的內(nèi)生真菌有關(guān)，它們之間存在正相關(guān)關(guān)系和負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明內(nèi)生真菌部位間的差異與宿主植物部位間成分差異相關(guān)。有效成分(Taxol與10-DABⅢ)含量與一

8、些有組織特異性的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群的分布存在顯著的相關(guān)性。與Taxol含量顯著相關(guān)的有：在目水平上，Helotiales、Hypocreales、Xylariales目；在屬水平上，Hypocrea，Pezicula屬；在種水平上，Hypocrealixii。與10-DABⅢ的含量顯著相關(guān)的有：在目水平上，Botryosphaeriales、Magnaporthales目；在屬水平上，F(xiàn)usarium/Gibberella、Phyllostict

9、a/Guignardia屬；在種水平上，Colletotrichumg loeosporioides，Glomerella lindemuthiana，Magnaporthales sp.2、Xylarialessp.1。Taxol或10-DABⅢ的含量和與其相關(guān)的不同內(nèi)生真菌類(lèi)群的相對(duì)頻率之間的關(guān)系均最符合立方模型(CubicModel)。研究闡明內(nèi)生真菌對(duì)藥材品質(zhì)(有效成分的含量)的影響，對(duì)提高藥材品質(zhì)、篩選優(yōu)質(zhì)藥材具有重要的理論價(jià)

10、值和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 通過(guò)稻瘟霉模型篩選和與宿主化學(xué)成分比較分析相結(jié)合的方法，對(duì)鑒定的145個(gè)內(nèi)生真菌分類(lèi)單元發(fā)酵提取物進(jìn)行篩選，以Perenniporia tephropora(Z41)的抗稻瘟霉活性最好，并且與宿主共有的分子特征離子數(shù)目最多，因此對(duì)該菌發(fā)酵物乙酸乙酯提取部位進(jìn)行分離，利用波譜方法共鑒定了5個(gè)化合物，1個(gè)新型的倍半萜類(lèi)化合物PerenniporinA和4個(gè)已知化合物2-5依次為ergosterol、rel-(+

11、)-(2aR，5R，5aR，8S，8aS，8bR)-decahydro-2，2，5，8-tetramethyl-2H-naphtho[1，8-bc]furan-5-ol、albicanol、para-methoxybenzoic acid，這些化合物都是首次從Perenniporia屬真菌分離得到。Perenniporia tephropora發(fā)酵物的乙酸乙酯提取物(EPT)及5個(gè)化合物對(duì)HeLa細(xì)胞，SMMC-7721和PANC-1細(xì)