冬凌草內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：研究冬凌草內(nèi)生真菌與其次生代謝產(chǎn)物(冬凌草甲素)之間的相關(guān)性。篩選從冬凌草中分離出的內(nèi)生真菌中產(chǎn)冬凌草有效抗腫瘤的活性成分的菌株，將篩選出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行物理及化學(xué)方法的誘變以及對(duì)誘變后的變異菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化，從而獲得冬凌草甲素的高產(chǎn)菌株。并對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，確定其分類(lèi)學(xué)地位。并對(duì)此菌株進(jìn)行體外乳腺癌細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，研究其抗癌活性。
　　方法：本課題以冬凌草不同器官（葉片、莖）為實(shí)驗(yàn)材料，采用組織塊分離法對(duì)冬凌

2、草進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離并純化至單一菌落，保存?zhèn)溆茫M(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定，明確冬凌草內(nèi)生真菌的生物多樣性。并采用薄層色譜法及高相液相色譜法篩選出產(chǎn)冬凌草甲素的內(nèi)生真菌；采用紫外線誘變、亞硝酸鈉誘變和復(fù)合誘變等方法對(duì)產(chǎn)冬凌草甲素菌株進(jìn)行誘變處理，篩選出高產(chǎn)菌株，對(duì)此高產(chǎn)誘變菌株進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用高效液相色譜法測(cè)定突變菌株冬凌草甲素的產(chǎn)量；結(jié)合分子生物學(xué)理論對(duì)產(chǎn)冬凌草甲素的菌株M-J-5進(jìn)行鑒定；采用

3、MTT法檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1、冬凌草內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的研究
　　現(xiàn)已從冬凌草葉片及莖中分離出內(nèi)生真菌共256株，經(jīng)顯微結(jié)果鑒定這些內(nèi)生真菌分布在4目、6科、9屬中，青霉屬菌株鑒定出77株，占所有內(nèi)生真菌總數(shù)的30.1％，擬定為冬凌草內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌。
　　2、產(chǎn)冬凌草甲素的冬凌草內(nèi)生真菌的研究
　　對(duì)冬凌草葉片及莖中內(nèi)生真菌進(jìn)一步分離，利用薄層色譜法法和高效液相色

4、譜法對(duì)上述256株內(nèi)生真菌進(jìn)行檢測(cè)，篩選出2株產(chǎn)冬凌草甲素的菌株，M-J-5為產(chǎn)冬凌草甲素含量最高的菌株，冬凌草甲素產(chǎn)量為0.211g/L。該株內(nèi)生真菌分離自冬凌草的莖中。
　　3、內(nèi)生真菌M-J-5生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及誘變育種
　　利用紫外線、NaNO2誘變和紫外線-亞硝酸鈉、亞硝酸鈉-紫外線復(fù)合誘變的方法，對(duì)產(chǎn)冬凌草甲素的菌株 M-J-5進(jìn)行誘變處理，篩選出冬凌草甲素的高產(chǎn)突變菌株M-UH-4，該菌株的產(chǎn)量可達(dá)到0.219g

5、/L，與原始菌株M-J-5相比較冬凌草甲素的產(chǎn)量增加了4.11%，對(duì)該突變菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀測(cè)其冬凌草甲素產(chǎn)量的變化，結(jié)果表明M-UH-4具有一定的遺傳穩(wěn)定性。
　　4、高產(chǎn)誘變菌株M-UH-4發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　運(yùn)用溫度、接種量、轉(zhuǎn)速、PH值、碳源、氮源等的單因素實(shí)驗(yàn)和四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)的方法，確定高產(chǎn)誘變菌株M-UH-4最優(yōu)的發(fā)酵條件：設(shè)定PDB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的初始pH為7.0，葡萄糖加入量為10.0

6、g/L、蛋白胨5.0g/L，以2%的接種量接種于裝樣量為50mL培養(yǎng)基中，搖床溫度設(shè)定為26℃恒溫，轉(zhuǎn)速為130r/min，連續(xù)培養(yǎng)6天。與原始培養(yǎng)條件對(duì)比，菌株M-UH-4的冬凌草甲素產(chǎn)量為0.221g/L，增幅4.74%。與誘變后相比增幅1.28%。菌絲干重為8.99 g/L，增幅17.9%，與誘變后相比增幅12.15、內(nèi)生真菌M-J-5的分子生物學(xué)鑒定
　　通過(guò)CTAB法提取產(chǎn)冬凌草甲素的內(nèi)生真菌M-J-5的DNA，并對(duì)其進(jìn)

7、行ITS測(cè)序，同時(shí)選取NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性高的序列與該內(nèi)生真菌的ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并與其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果綜合分析，確定內(nèi)生真菌M-J-5為青霉屬青霉。
　　6、MTT比色法檢測(cè)M-UH-4發(fā)酵液提取物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　采用MTT法檢測(cè)不同濃度發(fā)酵液提取物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，在稀釋10-3時(shí)，在24h、48h、72h時(shí)致死率分別為78.27%、83.62%、83.96%，結(jié)果表明冬凌草內(nèi)生真

8、菌M-UH-4次生代謝產(chǎn)物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞具有較明顯的抑制作用。
　　結(jié)論：通過(guò)對(duì)冬凌草內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物相關(guān)性的研究，得到了冬凌草中內(nèi)生真菌的類(lèi)型及種群結(jié)構(gòu)，充分說(shuō)明了冬凌草中內(nèi)生真菌具有一定程度的生物多樣性；同時(shí)篩選出一株產(chǎn)冬凌草甲素的活性菌株（M-J-5），通過(guò)誘變獲得一株高產(chǎn)突變菌株（M-HU-4）提高了冬凌草甲素產(chǎn)量；并篩選出適合該誘變菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件；經(jīng)分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定表明該突變菌株為青霉屬青霉；通過(guò)體外抗