多穗金粟蘭內(nèi)生真菌分離、鑒定及其次生代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指在其部分或全部生活史生活在植物的各種組織和器官細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙中，對(duì)宿主不表現(xiàn)明顯病害的一類真菌。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生多種與宿主植物相同或相似以及結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)。金粟蘭屬（Chloranthus swarts）植物是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，其化學(xué)成分具有抗腫瘤、抗菌、增強(qiáng)免疫等活性。全球共有15種，主要分布于亞洲東部和南部，其中我國(guó)約有13種5變種，且多分布于西南地區(qū)。到目前為止，有

2、關(guān)金粟蘭屬植物的研究與開(kāi)發(fā)還尚不深入，而且在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)到有關(guān)金粟蘭屬植物內(nèi)生真菌研究的任何報(bào)道?；诖?，本文以金粟蘭屬（Chloranthus swarts）植物多穗金粟蘭（Chloranthus multistachys）為研究對(duì)象，從其根、莖、葉3部分組織中共分離獲得65株內(nèi)生真菌，并對(duì)所分離的內(nèi)生真菌進(jìn)行了鑒定和抑菌活性篩選，優(yōu)選出兩株具有較高抑菌活性的菌株CL39和CL61，且進(jìn)一步對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)成分分離與鑒定。主要

3、研究結(jié)果如下:
　　1.較為系統(tǒng)地研究了多穗金粟蘭內(nèi)生真菌的分布特點(diǎn)。采用組織分離法和3種分離培養(yǎng)基，從多穗金粟蘭的根、莖、葉3部分組織中共分離純化得到65株內(nèi)生真菌。從分布來(lái)看，不同部位分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量不同，莖中分離得到的內(nèi)生真菌有29株，占總數(shù)的45％;葉和根次之，分別有27和9株，占總數(shù)的42％和14％。根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定表明，65株內(nèi)生真菌分屬于2個(gè)亞門(mén)、3個(gè)綱、6個(gè)目、6個(gè)科、10個(gè)屬，分別為鐮孢霉屬(F

4、usariumsp.)、頭孢霉屬（Cephalosporium sp.）、粘帚霉屬（Gliocladium sp.）、暗雙孢屬(Cordanasp.)、絲核菌屬（Rhizoctonia sp.）、盤(pán)色多隔霉屬(Coryneum sp.)、刺盤(pán)孢屬（Colletotrichum sp.）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis sp.）、擬隱孢殼屬(Cryptosporiopsissp.)、擬盤(pán)多毛菌屬（Pestalotiopsis sp.）。其

5、中，鐮孢霉屬（Fusarium sp.）、頭孢霉屬（Cephalosporium sp.）、盤(pán)色多隔霉屬（Coryneum sp.）為優(yōu)勢(shì)種群，分別占菌株總數(shù)的15.4％、13.8％、13.8％。由此可知，多穗金粟蘭內(nèi)生真菌在數(shù)量、分布和種群等方面都存在差異，具有較為豐富的物種多樣性。
　　2.采用抑制菌絲生長(zhǎng)率法測(cè)定了65株內(nèi)生真菌發(fā)酵濾液對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌等7種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用?；钚詼y(cè)試結(jié)果顯示，在離體條件下，至少對(duì)

6、一種植物病原真菌生長(zhǎng)抑制率在75％以上的活性菌株有43株，占總菌株數(shù)的66.2％;至少對(duì)3種病原菌抑制作用達(dá)30％以上的有39株，約占總數(shù)的60％;對(duì)7種病原菌抑制作用均達(dá)到30％以上的有9株，約占總數(shù)的13.8％。其中菌株CL39、CL61的發(fā)酵液7種病原菌抑菌率均在75％以上，具有較高的抑制活性。以上結(jié)果表明，多穗金粟蘭內(nèi)生真菌具有廣譜的抑菌活性。
　　3.根據(jù)真菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，CL39菌株為鐮刀菌屬（Fusa

7、rium sp.）真菌，CL61菌株為擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis sp.）真菌。根據(jù)之前對(duì)這兩屬真菌的研究可知，鐮刀菌屬和擬盤(pán)多毛孢屬均為活性菌株，其代謝產(chǎn)物多具有抗癌、殺菌等活性，值得進(jìn)一步研究。
　　4.對(duì)活性菌株CL39和CL61進(jìn)行液體發(fā)酵，并對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化。經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析、薄層制備層析等各種色譜技術(shù)分離純化，共分離得到6個(gè)化合物，綜合運(yùn)用1H-NMR、

8、13C-NMR、1H-1H COSY、DEPT、HMBC、HMQC等波譜技術(shù)，并與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比，鑒定了這6個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，分別為:化合物CL391和CL392，環(huán)桉烯醇，(-)-(7S,8R)-dihydrodehydrodic onifery alcohol、12R,15-dihydroxylabda-8(17),13E-dien-19-oic acid和β-ecdysterone。其中，化合物CL391和CL392是兩個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的多