青霉屬真菌J-9產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵工藝研究及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物積雪草酸總單葡萄糖苷的分離與檢測.pdf

1、青霉屬真菌J-9能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，通過水解β-1，6-糖苷鍵將積雪草總苷轉(zhuǎn)化為積雪草酸單葡萄糖苷、羥基積雪草酸單葡萄糖苷和積雪草酸B單葡萄糖苷。本文對J-9菌株生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的液體發(fā)酵工藝和β-葡萄糖苷酶的提取分離技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，同時開展了積雪草總苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析研究。
　　 首先，利用β-D-葡萄糖苷酶能夠水解pNPG中的糖苷鍵，使之生成相應(yīng)的對硝基苯酚，對硝基苯酚與碳酸鈉結(jié)合而顯色的原理建立了

2、pNPG法檢測酶活方法。再以酶活為指標(biāo)進(jìn)行了J-9菌液體發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的工藝研究，比較了碳源的種類、添加量、培養(yǎng)基pH、底物濃度、溫度、培養(yǎng)基裝量和發(fā)酵時間對β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響，優(yōu)化產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最佳發(fā)酵工藝，即以3％麩皮和2％乳糖組成的培養(yǎng)基，加入3mg/mL積雪草總苷作為誘導(dǎo)劑，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH5.7，于32℃，200r/min搖瓶發(fā)酵7天。在此優(yōu)化條件下，J一9菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量達(dá)到了1.5 U/mL，

3、比在初始PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)酶能力提高了5倍。
　　 通過比較硫酸銨、乙醇和丙酮沉淀法對β-葡萄糖苷酶粗酶活性的影響以及緩沖鹽pH對于DEAE-52 Sepharose純化性能的影響，優(yōu)化出了β-葡萄糖苷酶提取工藝。發(fā)酵液離心分離菌絲體，上清液中加入30％飽和度的硫酸銨，離心，調(diào)整上清液中硫酸銨的飽和度為75％，離心，沉淀裝入透析袋中透析，透析液用Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH7.5，上DEAE-52 Sepharose離子交換層

4、析柱，用0.1M NaCl洗脫，得到純化的β-葡萄糖苷酶緩沖溶液，超濾管濃縮，上樣至SDS-PAGE凝膠電泳檢測純度和分子量，結(jié)果經(jīng)DEAE-52 Sepharose離子交換層析柱純化的β-葡萄糖苷酶具有2個條帶，其中主條帶的分子量為65.0kDa。同時，開展了β-葡萄糖苷酶的理化性質(zhì)研究，考察了溫度、pH、金屬離子等因素對酶的活性的影響，結(jié)果該β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH為4.5，最適反應(yīng)溫度為50℃，在20℃時穩(wěn)定性良好，不同的金屬

5、離子對酶的抑制作用不同，其中，K+對酶的抑制作用最強(qiáng)，其次是Al3+、Hg2+、Cu2+、Mg2+、Zn2+，而Fe3+對酶無明顯影響。
　　 J-9菌液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化積雪草總苷生成轉(zhuǎn)化產(chǎn)物積雪草酸總單葡萄糖苷，經(jīng)正丁醇萃取后，用適量甲醇溶解，上硅膠柱層析分離，用氯仿-甲醇-水(10:2:0.3，V/V)的混合溶液洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物A以及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物B、C混合物。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物B、C混合物進(jìn)一步上ODS C18柱層析，用β-CD(3

6、mg/ml)水溶液-甲醇(1:1，V/V)的洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到了轉(zhuǎn)化產(chǎn)物B和C。通過比旋度測定、高低分辨質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)對三者進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確認(rèn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物A、B和C分別為積雪草酸單葡萄糖苷、羥基積雪草酸單葡萄糖苷和積雪草酸B單葡萄糖苷，經(jīng)HPLC面積歸一化檢測，三者純度依次達(dá)到了96.0％、97.5％和100.0％。
　　 本研究通過添加流動相添加劑β-CD，實(shí)現(xiàn)了同分異構(gòu)體羥基積雪草酸單葡萄糖苷與積雪草酸B單葡

7、萄糖苷的分離，并通過條件優(yōu)化建立了積雪草總苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC定量分析方法：色譜柱Welch Materials，XB-C18柱(250×4.60 mm，5μm)；流動相：4 mmol/Lβ-CD水溶液(A，磷酸調(diào)節(jié)至pH2.8)-乙腈(B)，分級洗脫：1～15 min，B：26％；15～45 min，B：28％；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；檢測波長204 nm；進(jìn)樣量10μL。在此色譜條件下可以同時檢測積雪草酸單葡萄糖苷