用于大豆膳食纖維改性的里氏木霉工程菌的構(gòu)建.pdf

1、膳食纖維對(duì)人體健康具有特殊的生理功能，因此膳食纖維類食品受到消費(fèi)者的歡迎，而可溶性膳食纖維被證實(shí)具有更好的生理作用和功能特性。目前，大豆可溶性膳食纖維主要通過酶法降解豆渣制備。但是所用的酶制劑含有多種酶組分，每種酶對(duì)大豆膳食纖維的改性可能發(fā)揮著不同的作用。里氏術(shù)霉內(nèi)切葡聚糖酶EGⅡ、內(nèi)切木聚糖酶XYNⅠ和XYNⅡ有利于可溶性膳食纖維的生成，而木糖苷酶XYND、β-葡萄糖苷酶BGLⅠ、內(nèi)切葡聚糖酶EGⅠ、外切葡聚糖酶CBHI等組分不利于可

2、溶性膳食纖維的生成。由此導(dǎo)致酶法制備大豆可溶性膳食纖維產(chǎn)量低、質(zhì)量差、工藝不穩(wěn)定等問題。因此，利用基因工程技術(shù)培育工程菌，增加有利酶組分、降低不利酶組分，以提高可溶性膳食纖維的產(chǎn)量和質(zhì)量，具有重要的研究?jī)r(jià)值。
　　 本課題利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化里氏木霉QM9414，敲除其木糖苷酶基因xynd和β-葡萄糖苷酶基因bglⅠ，試圖為大豆可溶性膳食纖維的生產(chǎn)提供酶制劑工程菌。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)

3、的里氏木霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件，主要從共培養(yǎng)的時(shí)間、溫度、和菌體的濃度等方面進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明當(dāng)乙酰丁香酮的濃度為200μmol/L，共培養(yǎng)時(shí)間為42h，溫度24℃，孢子濃度為107個(gè)/ml和農(nóng)桿菌初始濃度OD660為0.25時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較高。
　　 2.△ura3缺陷型菌株的篩選構(gòu)建了ura3缺失基因的載體pEMT-△ura3，并將pEMT-△ura3質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，與里

4、氏木霉共培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子，獲得ura3缺陷型菌株1株，其同源重組率為16.6％。
　　 3.△ku70缺陷型菌株篩選構(gòu)建了ku70基因敲除載體pEMT-pyrA，并將pEMT-pyrA質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，與ura3缺陷性菌株共培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子，獲得ku70缺陷型菌株1株，其同源重組率為25％。
　　 4.里氏木霉木糖苷酶xynd基因、bglⅠ基因的敲除通過重疊延伸PCR的方法將.xynd5，bgⅠ3，