非解朊棲熱菌HG102耐熱β-糖苷酶的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、非解朊棲熱菌HG102耐熱β-糖苷酶Tn-gly為(β/a)<,8>桶狀結(jié)構(gòu),具有水解功能和轉(zhuǎn)糖苷功能的耐熱單體酶.該酶可作為一個(gè)很好的模型來(lái)研究糖苷酶的反應(yīng)機(jī)制,底物特異性和耐熱的分子基礎(chǔ).根據(jù)對(duì)該酶的晶體結(jié)構(gòu)解析和同家族酶的結(jié)構(gòu)比較,推測(cè)Glu164和Glu338分別是質(zhì)子供體和親核基團(tuán)兩個(gè)活性位點(diǎn);在a-螺旋N端第一位的脯氨酸和蛋白質(zhì)外周的精氨酸是耐熱機(jī)制的關(guān)鍵位點(diǎn)和關(guān)鍵氨基酸殘基.該論文為了鑒定這些氨基酸殘基的功能,通過(guò)基因定點(diǎn)

2、突變的方法分別把Glu164、Glu338、Pro316、Pro356、Pro344和Arg325置換成Gln、Ala、Gly、Ala、Phe和Leu,同時(shí)還對(duì)Pro316和Pro356進(jìn)行了雙置換.各個(gè)突變基因均得到表達(dá),突變酶經(jīng)過(guò)純化得到電泳純;用CD光譜進(jìn)行了野生酶和突變酶的結(jié)構(gòu)比較.通過(guò)突變酶的酶功能和酶學(xué)性質(zhì)分析,結(jié)果表明Glu164和Glu338分別β-糖苷酶Tn-gly水解反應(yīng)時(shí)地質(zhì)子供體和親核基團(tuán),親核基團(tuán)的突變酶Tn-

3、glyE338A可以合成混合型糖苷鍵寡糖類(lèi)似物;脯氨酸的剛性結(jié)構(gòu)在a-螺旋N端第一位和精氨酸在蛋白質(zhì)外周形成離子鍵是耐熱機(jī)制的關(guān)鍵位點(diǎn)和關(guān)鍵氨基酸殘基.另外,通過(guò)同家族酶與自然底物、合成底物或抑制劑共結(jié)晶的結(jié)構(gòu)分析和同源性比對(duì),初步推測(cè)非解朊棲熱菌HG102耐熱β-糖苷酶的Gln18和Glu392與酶既有葡萄糖苷酶活性又有半乳糖苷酶活性有關(guān),Asn282和Tyr284與酶的甘露糖苷活性有關(guān),Trp385的疏水吲哚側(cè)連對(duì)底物在酶活性中心的