Exendin-4抑制t-BHP誘導(dǎo)的HUVECs凋亡-與PI3k-Akt-Bcl-2通路有關(guān).pdf

1、背景和目的：內(nèi)皮細(xì)胞在修復(fù)血管損傷和保持血管內(nèi)膜完整性方面具有強(qiáng)大功能。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的異常增加是動(dòng)脈粥樣硬化起始和發(fā)展的重要因素。本課題研究氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞存活信號(hào)通路PI3k/Akt-Bcl-2的分子變化，并在此基礎(chǔ)上加用GLP-1受體激動(dòng)劑Exendin-4，研究其對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，以及該作用與上述通路的關(guān)系，從而初步探討Exendin-4的內(nèi)皮保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：以體外培養(yǎng)的

2、HUVECs為研究對(duì)象。不同濃度（50～800μmol/L）t-BHP處理HUVECs 1～4 h，MTT法測內(nèi)皮細(xì)胞生存率；Hoechst/PI雙染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡率；Western blot測Akt、p-Akt、Bcl-2以及caspase-3在t-BHP（100μmol/L）作用下各時(shí)間點(diǎn)（0、0.5、1、2、4、6 h）的表達(dá)情況。在參照第一部分的基礎(chǔ)上，不同濃度的Exendin-4（2.5～25 nmol/L）預(yù)處理H

3、UVECs 18 h，適宜濃度t-BHP（100μmol/L）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，再次用MTT法和Hoechst/PI雙染熒光顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞生存及凋亡情況。Exendin-4（25 nmol/L）預(yù)處理細(xì)胞18 h，加用PI3k抑制劑wortmannin (100nmol/L)，Western blot檢測各組凋亡分子caspase-3以及PI3k/Akt-Bcl-2通路蛋白分子表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：t-BHP呈時(shí)間和濃

4、度依賴性地抑制HUVECs生存；進(jìn)一步Hoechst/PI染色熒光顯微鏡觀察證實(shí)這種抑制作用是誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生凋亡和壞死。當(dāng)t-BHP濃度在50～100μmol/L時(shí)，HUVECs以凋亡為主（8.2％±0.59、37.3％±1.65，P＜0.01）；當(dāng)t-BHP濃度大等于200μmol/L時(shí)，HUVECs以壞死為主（4.3％±0.57，15.5％±1.38，36.2％±2.19，P＜0.01）；Western blot結(jié)果顯示cas

5、pase-3的活化片段在4 h表達(dá)量最高?；罨腁kt在30min時(shí)表達(dá)達(dá)高峰，隨后降低。Bcl-2表達(dá)呈現(xiàn)遞減的趨勢。加用Exendin-4后，發(fā)現(xiàn)用Exendin-4 （25 nmol/L)預(yù)處理過的內(nèi)皮細(xì)胞生存率與單獨(dú)t-BHP處理組相比增加了46.5％（P＜0.01），而細(xì)胞凋亡率與單獨(dú)t-BHP處理組相比也顯著下降(8.0％±1.45vs36. 0％±1.25, P＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示與t-BHP單獨(dú)

6、處理組相比， Exendin-4+t-BHP處理組的caspase-3活化片段的表達(dá)量下降了48.53％（P＜0.01），p-Akt表達(dá)量增加了1.78倍（P＜0.01），同時(shí)Bcl-2的表達(dá)也增加了1.08倍（P＜0.01）。表明Exendin-4能夠抑制t-BHP誘導(dǎo)的HUVECs凋亡。但這一效應(yīng)能夠被PI3k的抑制劑wortmannin抑制。
　　 結(jié)論：氧化應(yīng)激誘導(dǎo)caspase依賴的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這一病理過程與活化Ak