新型反膠束介質(zhì)中酶催化性能研究.pdf

1、利用酶進(jìn)行物質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)化，是生物學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域交叉研究的熱點(diǎn)之一，也是21世紀(jì)化學(xué)發(fā)展的趨勢(shì)。其中，酶活力的保持和提高是生物合成與轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。為了達(dá)到這一目的，除了可以通過(guò)酶的分子工程將酶進(jìn)行修飾或改造之外，還可以對(duì)酶反應(yīng)的微環(huán)境進(jìn)行改變或修飾，后者及所謂的酶催化介質(zhì)工程。 介質(zhì)工程的研究經(jīng)歷了從水→有機(jī)溶劑→反膠束的過(guò)程。在水/有機(jī)溶劑兩相體系和微水有機(jī)溶劑單相體系中，酶通常不能保持很好的催化性能。由于反膠束體系能夠較好地模擬

2、酶的天然環(huán)境，因而在反膠束體系中，大多數(shù)酶能夠保持催化活性和穩(wěn)定性。但是，目前的研究還存在著一些問(wèn)題。首先，大多數(shù)研究都是基于商品化的離子型表面活性劑如二（2-乙基己基）琥珀酸磺酸鈉（AOT）構(gòu)成的反膠束來(lái)進(jìn)行的，在這樣的體系中，位于反膠束界面的表面活性劑的帶電頭基與水池中的酶之間往往存在強(qiáng)的靜電作用力，從而導(dǎo)致酶活力的降低或喪失；其次，目前所有用于酶催化的反膠束體系都是用傳統(tǒng)有機(jī)溶劑來(lái)形成的，這不僅會(huì)對(duì)酶活力構(gòu)成影響，更對(duì)環(huán)境保護(hù)提出

3、了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此，對(duì)構(gòu)成反膠束的兩大要素-表面活性劑和有機(jī)相進(jìn)行改進(jìn)是非常必要的。本論文分別從表面活性劑和溶劑兩方面出發(fā)，論述了新型反膠束介質(zhì)的構(gòu)建，并且對(duì)酶在其中的催化性能進(jìn)行了研究。 一.新型非離子表面活性劑反膠束的構(gòu)建及其中的酶催化反應(yīng) 目前用于酶催化研究的反膠束介質(zhì)大多是用陰離子表面活性劑AOT來(lái)構(gòu)成的。然而，在此體系中酶受界面電性質(zhì)的影響活力往往不高。向AOT反膠束體系中添加非離子表面活性劑以提高酶活力的研究

4、已有報(bào)道，但這樣做只能在一定程度上減弱而不能消除界面電性質(zhì)對(duì)酶活的影響。利用非離子型表面活性劑構(gòu)建反膠束可以大大減弱酶與表面活性劑間的靜電相互作用，然而現(xiàn)有的商品化的非離子表面活性劑大多需要添加極性醇等助表面活性劑且反膠束大小只能在小范圍內(nèi)可控。因此，很有必要嘗試新型雙尾基非離子表面活性劑。為此，我們合成了具有雙尾基和糖頭基的非離子型表面活性劑N-葡萄糖基谷氨酸二癸基酯（GGDE），并用來(lái)形成新型反膠束體系。 在由GGDE和Tr

5、itonX-100（TX-100）構(gòu)成的復(fù)配反膠束體系中，以木素過(guò)氧化物酶（LiP）催化氧化藜蘆醇（VA）的反應(yīng)為指示反應(yīng)，研究了反膠束大小，緩沖溶液的pH以及H2O2濃度對(duì)LiP催化活力的影響。結(jié)果表明，在最佳反應(yīng)條件下，LiP在GGDE/TX-100反膠束中的催化效率是其在AOT反膠束中的40多倍。在GGDE/TX-100反膠束中，非離子表面活性劑頭基與LiP之間不存在強(qiáng)的靜電作用力，LiP的活力得到充分發(fā)揮。 酵母醇脫氫酶

6、（YADH）在GGDE/TX-100反膠束中的催化性能的研究再次證明了GGDE/TX-100反膠束作為酶催化反應(yīng)介質(zhì)的優(yōu)越性。將YADH催化輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）氧化乙醇的反應(yīng)作為指示反應(yīng)，在各自的最佳反應(yīng)條件下，YADH在GGDE/TX-100反膠束中的催化活力明顯高于AOT反膠束中的活力。就動(dòng)力學(xué)研究而言，YADH在GGDE/TX-100反膠束中催化反應(yīng)的的轉(zhuǎn)化數(shù)是AOT反膠束中的1.4倍，而底物乙醇和輔酶NAD+在A

7、OT反膠束中的米氏常數(shù)分別是GGDE/TX-100反膠束中的2倍和5倍。由此說(shuō)明，膠束界面不僅會(huì)對(duì)YADH本身產(chǎn)生影響，對(duì)帶有正電荷的輔酶NAD+的影響更加顯著。在AOT反膠束中，頭基與NAD+之間存在強(qiáng)的靜電吸引力，導(dǎo)致輔酶與YADH結(jié)合減弱。從而，YADH在GGDE/TX-100反膠束中的催化效率要遠(yuǎn)大于在AOT反膠束中的催化效率。 二.離子液體對(duì)醇脫氫酶失活機(jī)制的探討以及離子液體微乳液的應(yīng)用 “綠色溶劑”室溫離子液

8、體（RTILs）作為酶催化反應(yīng)介質(zhì)引起了研究者們的興趣。1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIM][PF6]是一種普通的疏水性離子液體。據(jù)報(bào)道，醇脫氫酶（ADH）在緩沖液和[BMIM][PF6]兩相體系中是具有催化活力的。但是，在[BMIM][PF6]和親水性離子液體（如1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽[EMIM][BF4]）的單相體系中，ADH是沒(méi)有催化活力的。為了弄清離子液體對(duì)ADH的失活作用及其機(jī)理，本文定量研究了離子液體[B

9、MIM][PF6]對(duì)酵母醇脫氫酶（YADH）催化活力的影響以及相關(guān)的抑制機(jī)制，并且首次將離子液體微乳液引入酶催化反應(yīng)。結(jié)果表明，在由H2O，CH3CH2OH和[BMIM][PF6]構(gòu)成的均相溶液中，YADH活力隨著[BMIM][PF6]摩爾分?jǐn)?shù)的增加而迅速下降。[BMIM][PF6]對(duì)YADH的抑制作用可能是通過(guò)[BMIM][PF6]中的咪唑基團(tuán)與輔酶NAD+競(jìng)爭(zhēng)YADH的結(jié)合位點(diǎn)而引起的。同理可以解釋季銨型離子液體對(duì)醇脫氫酶的失活作用

10、。將酶促反應(yīng)置于[BMIM][PF6]微乳液中進(jìn)行時(shí)，YADH顯示出催化活性。在離子液體微乳液中，表面活性劑構(gòu)成的界面膜將YADH與離子液體[BMIM][PF6]隔離開(kāi)來(lái)，從而避免了[BMIM][PF6]對(duì)YADH的直接失活作用。在此微乳液中，YADH的催化活力能夠達(dá)到51μM min-1。這是在離子液體微乳液中進(jìn)行酶催化反應(yīng)的首次報(bào)道。 三.新型離子液體微乳液的研究 隨著離子液體應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)展，對(duì)離子液體中的生物催

11、化的研究活躍起來(lái)。實(shí)驗(yàn)表明，多種酶在離子液體或離子液體/水兩相體系中體現(xiàn)出了較好的催化活力和立體選擇性。但是，值得注意的是，研究證明只有懸浮在離子液體中的酶才具有催化活力，溶解在離子液體中的酶卻是沒(méi)有催化活力的，這就大大限制了酶的催化效率的發(fā)揮。H2O/TX-100/[BMIM][PF6]離子液體微乳液作為能夠?qū)⒚竼畏肿铀椒稚⒌木嗳芤罕挥脕?lái)嘗試作酶催化反應(yīng)介質(zhì)取得了成功。我們的研究表明酵母醇脫氫酶、木素過(guò)氧化物酶以及漆酶在此體系中都

12、能夠保持催化活力。但這一離子液體微乳液相區(qū)大部分都在表面活性劑含量很高（>50％，W/W）的區(qū)域。這樣以來(lái)會(huì)導(dǎo)致酶活力的損失以及反應(yīng)后處理非常麻煩。所以，有必要開(kāi)發(fā)表面活性劑含量較低的離子液體微乳液。AOT在有機(jī)溶劑中能夠形成穩(wěn)定的聚集體，并且具有良好的增溶水的能力，是傳統(tǒng)反膠束中最常用的表面活性劑，于是我們嘗試將AOT引入離子液體微乳液的構(gòu)建。即在溶有適量非離子表面活性劑TX-100的離子液體中溶入少量的AOT，并加水使之形成微乳液。

13、本文詳細(xì)論述了H2O/AOT-TX-100/[BMIM][PF6]離子液體微乳液的構(gòu)建和形成，并且對(duì)這種新型離子液體微乳液中的酶催化反應(yīng)進(jìn)行了初步的研究。以脂肪酶（lipase）催化的酯交換反應(yīng)作為指示反應(yīng)，研究了lipase在此微乳液體系中的催化性能。將lipase在幾種離子液體微乳液中的催化活力作比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，lipase在H2O/AOT-TX-100/[BMIM][PF6]微乳液中的催化活力與H2O/TX-100/[BMIM][PF