解淀粉芽孢桿菌barnase-barstar分子調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建及在煙草花發(fā)育調(diào)控中的應(yīng)用研究.pdf

1、Barnase是一種來源于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的細(xì)胞致死因子，Barstar是Barnase的抑制因子，barnase-barstar構(gòu)成一對(duì)分子開關(guān)可以應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控研究。barnase在花序分生組織中由花序分生組織特異啟動(dòng)子AtREM1啟動(dòng)表達(dá)能夠使花序分生組織細(xì)胞死亡從而抑制植物開花，使植物不能進(jìn)入生殖生長而長期處于營養(yǎng)生長狀態(tài)。barstar的表達(dá)可以阻止barnase的致死作

2、用，從而使植物恢復(fù)其育性進(jìn)入生殖生長狀態(tài)產(chǎn)生種子。Barstar由一個(gè)嵌合啟動(dòng)子MRE35S90啟動(dòng)，該基因的表達(dá)受到人工施加化學(xué)誘導(dǎo)劑銅離子的控制，當(dāng)無化學(xué)誘導(dǎo)劑時(shí)該基因并不轉(zhuǎn)錄表達(dá)，當(dāng)人工添加誘導(dǎo)劑時(shí)，該誘導(dǎo)劑與誘導(dǎo)劑作用基因ace1結(jié)合，從而使響應(yīng)啟動(dòng)子啟動(dòng)barstar的表達(dá)。
　　本試驗(yàn)所構(gòu)建的植物生殖器官調(diào)控系統(tǒng)可以在特定的時(shí)間和空間進(jìn)行表達(dá)，可以根據(jù)人們不同的需要來進(jìn)行人工控制。
　　本試驗(yàn)通過培養(yǎng)解淀粉芽孢桿

3、菌，提取基因組，設(shè)計(jì)引物，通過PCR的技術(shù)手段獲得了目的基因barnase及其抑制基因barstar;通過種植培養(yǎng)野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)，并通過提取其總基因組DNA，設(shè)計(jì)目的基因引物，獲得花序分生組織特異型啟動(dòng)子AtREM1啟動(dòng)barnase的表達(dá);通過培養(yǎng)野生豌豆（ViciaLinn），提取總基因組，設(shè)計(jì)引物，得到豌豆rbcs3A終止子;培養(yǎng)農(nóng)桿菌通過PCR手段獲得NOS終止子;培養(yǎng)釀酒酵母(Sacch

4、aromycescerevisiae)通過PCR獲得ace1基因;人工合成MRE35S90啟動(dòng)子和CaMV35S啟動(dòng)子分別啟動(dòng)barstar和ace1的表達(dá)。
　　將獲得的各基因組合獲得重組表達(dá)質(zhì)粒命名為RBCu，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，使用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化優(yōu)質(zhì)煙草品種NC89從而獲得轉(zhuǎn)基因煙草。
　　轉(zhuǎn)基因煙草的檢測采用抗除草劑的篩選、普通PCR檢測目的基因、Southernblot檢測以及實(shí)時(shí)熒光定量