沙門(mén)菌條碼基因研究及焦磷酸測(cè)序快速鑒定.pdf

1、在世界范圍內(nèi),沙門(mén)菌是引起食物中毒最常見(jiàn)的致病菌,目前由沙門(mén)菌引起的食品安全、公共衛(wèi)生等問(wèn)題較為突出。因此建立一種準(zhǔn)確、快速、實(shí)時(shí)、高通量的沙門(mén)菌鑒定方法對(duì)食品日常監(jiān)測(cè)和沙門(mén)菌爆發(fā)疫情的調(diào)查等具有重要的意義,本研究以條碼基因理論為基礎(chǔ)并結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)、鑒定沙門(mén)菌。
　　 論文內(nèi)容主要包括四部分:
　　 1、沙門(mén)菌條碼基因的初步確定
　　 通過(guò)查閱大量中外文獻(xiàn),選擇鑒定沙門(mén)菌最常用的invA、iroB、hn

2、s、hisJ、hilA、fimY基因作為研究對(duì)象,在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載這六個(gè)基因相應(yīng)的基因序列,通過(guò)多重序列比對(duì)確定每個(gè)基因的目的片段。采用Assay design軟件設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物和測(cè)序引物并初步確定了沙門(mén)菌的條碼基因。
　　 2、沙門(mén)菌條碼基因焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法的建立
　　 優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件以及焦磷酸測(cè)序體系以提高本實(shí)驗(yàn)的可操作性。PCR擴(kuò)增體系為:2×GoTaq Master Mix1

3、2.5μl,上游引物和下游引物各5 pmol,DNA模板2μl,加無(wú)菌去離子水至25μl。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性20 s,56℃退火30 s,72℃延伸20 s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸5 min。焦磷酸測(cè)序體系采用20μl的PCR產(chǎn)物加入量和優(yōu)化的堿基加入程序。10株沙門(mén)菌和10株非沙門(mén)菌的測(cè)序結(jié)果顯示沙門(mén)菌均測(cè)序出相應(yīng)的核酸序列,非沙門(mén)菌均未測(cè)序出DNA序列,表明該方法可用于沙門(mén)菌的鑒定。對(duì)測(cè)序序列在線Blas

4、t比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)測(cè)序的DNA片段均存在多態(tài)性位點(diǎn),這些堿基的多樣化并不會(huì)對(duì)沙門(mén)菌鑒定的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。
　　 3、大量已知菌株對(duì)該方法的驗(yàn)證
　　 用已建立的方法對(duì)205株沙門(mén)菌和60株非沙門(mén)菌同時(shí)進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示所有沙門(mén)菌均測(cè)序出相應(yīng)的DNA序列,非沙門(mén)菌中只有一株鮑氏志賀氏菌測(cè)序結(jié)果與沙門(mén)菌hilA基因的條碼基因一致,于是在沙門(mén)菌條碼基因中刪除了該基因以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。通過(guò)對(duì)大量已知菌株的鑒定進(jìn)一步驗(yàn)證了所建立檢

5、測(cè)方法的準(zhǔn)確性和可行性,同時(shí)體現(xiàn)了該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、高通量的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)最終確定的鑒定沙門(mén)菌的條碼基因?yàn)?invA基因條碼基因:TGTTAATTGCGATTAGTGCCGGTTTTATCG；TGCTGATTGCGATTAGTGCCGGTTTTATCG; TGTTGATTGCGATTAGTGCCGGTTTTATCG; TGTTGATTGCTATTAGTGCCGGTTTTATCG; TGCTGATTGCGATTAGTGCTGGTT

6、TTATCG; TGTTGATTGCCATTAGTGCTGGTTTTATCG。iroB基因條碼基因:GGAGATAACCGGCTCTCCGTCATTTTGCAG; GGAGATAACCGGCTCTCCGTCATTTGGCAG。hns基因條碼基因:AGTTGTCGTTAATGAGCGTCGTGAAGAAGA; AGTTGTCGTTAACGAGCGTCGTGAAGAAGA:AGTTGTTGTTAATGAGCGTCGTGAAGAAGA。his

7、J基因條碼基因:CTFCTCATCTTTCACCGCCGGGCCGCCGAA; GTTCTCATCTTTCACCGCCGGGCCGGCAAA; TTTCTCATCTTTTACCGCCGGGCCGGCAAA; CTTCTCATCTTTCACCACCGGGCCGCCGAA。fimY基因條碼基因:TAGCGCAAGGCGCCTCTTTAAAAGAAA; TAGCGCAAGGTGCCTCTTTAAAAGAAA; TAGCACAAGGCGCCTC