基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)利用線粒體12SrRNA基因進(jìn)行種屬鑒別的研究.pdf

1、目的：本課題的研究目的是篩選37種物種線粒體（mtDNA）序列中的種屬特異性位點(diǎn)，應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)建立簡(jiǎn)便易行的大鼠，鵝，豬，黃牛，山羊，雞，鴨，狗，小鼠，貓，鴿，人，馬，兔，驢，甲魚和鹿這17種常見動(dòng)物的法醫(yī)學(xué)種屬鑒別體系并進(jìn)行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究。
　　方法：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫查到的上述37個(gè)物種線粒體序列，利用DnaSP v5.10.1軟件篩選DNA中核酸差異大的目標(biāo)區(qū)域，分別命名為12S-1，12S-2，16S-1。針對(duì)3個(gè)目

2、標(biāo)區(qū)域，使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物分別進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增。通過優(yōu)化選擇目標(biāo)區(qū)域12S-2，使用PyroMarker Assay Design2.0軟件設(shè)計(jì)測(cè)序引物，利用PyroMarker Q96儀器進(jìn)行大鼠，鵝，豬，黃牛，山羊，雞，鴨，狗，小鼠，貓，鴿，人，馬，兔，驢，甲魚和鹿這17種PCR產(chǎn)物(片段大小約100 bp)測(cè)序，建立基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的種屬鑒定反應(yīng)體系，并抽取部分種屬樣本進(jìn)行Sanger測(cè)

3、序驗(yàn)證及靈敏度等法醫(yī)學(xué)驗(yàn)證研究。
　　結(jié)果：(1)建立了基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)12S rRNA基因進(jìn)行種屬鑒定體系。焦磷酸測(cè)序分析結(jié)果顯示該方法僅需要12個(gè)堿基數(shù)就可以快速準(zhǔn)確地區(qū)分。(2)本方法能夠準(zhǔn)確分型的最低DNA模板量為250pg;對(duì)煮熟肉類、陳舊血痕和未知種屬來源的樣本均能有效鑒別。
　　結(jié)論：本研究建立的基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)分析12S rRNA基因的鑒別體系，可以成功鑒別大鼠，鵝，豬，黃牛，山羊，雞，鴨，狗，小鼠，