參芍口服液對(duì)2型糖尿病大鼠肝損傷的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：通過(guò)構(gòu)建2型糖尿病大鼠肝損傷模型，以不同劑量參芍口服液進(jìn)行干預(yù)，觀察血清生化指標(biāo)、肝組織形態(tài)學(xué)以及肝組織TLR4、NF-κB、TGF-β1等炎癥因子的表達(dá)水平的變化，探討參芍口服液對(duì)糖尿病肝損害的干預(yù)作用及其可能機(jī)制。
　　方法：1分組：將50只170~200g的清潔級(jí)（Specific Pathogen Free，SPF）雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組（Control, C）、模型組（Model, M）、參芍口服液:

2、低劑量治療組（Treatment of low-dose, T-L）、中劑量治療組（Treatment of medium-dose, T-M）、高劑量治療組（Treatment of high-dose, T-H），每組10只。2制作2型糖尿病大鼠模型：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對(duì)照組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組改用高脂飼料喂養(yǎng)，1個(gè)月后開(kāi)始造模。M、T-L、T-M、T-H組按25mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，

3、STZ）（濃度1％，pH4.5），C組腹腔內(nèi)注射等體積檸檬酸鈉緩沖液，連續(xù)2次空腹血糖≥16.7mmol/L，且有多飲、多尿、多食等出現(xiàn)，則可初步確認(rèn)2型糖尿病模型成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前再次測(cè)空腹血糖≥16.7mmol/L的為2型糖尿病模型成功，否則淘汰。3藥物干預(yù)：造模成功后，分別給予T-L、T-M、T-H組125mg/Kg、250mg/Kg、500mg/Kg參芍口服液灌胃，C、M組給予等體積蒸餾水灌胃，所有組別均灌胃8周。4取材及處理：8

4、周后，各組大鼠全部處死，取血及肝組織。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)大鼠血糖（GLU）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）等指標(biāo)，觀察經(jīng)參芍口服液干預(yù)后其變化情況；采用HE染色技術(shù)觀察各組大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)變化；采用Masson染色技術(shù)觀察各組大鼠肝組織纖維表達(dá)情況；采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)觀察各組大鼠肝組織TLR4、NF-κB、TGF-β1、IL-6、MMP

5、-9的定位表達(dá)；采用Western blot技術(shù)對(duì)各組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB、TGF-β1、IL-6、MMP-9的表達(dá)進(jìn)行半定量檢測(cè)。
　　結(jié)果：1模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿、精神不振、活動(dòng)減少、毛色暗淡、體重減輕等現(xiàn)象，并經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間觀察及3次檢測(cè)大鼠空腹血糖均明顯升高且穩(wěn)定，提示糖尿病大鼠模型成功；另外，模型組大鼠血清ALT、AST水平明顯高于對(duì)照組，且HE顯示肝細(xì)胞彌漫性腫脹，水樣變性，竇間隙變窄，可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死，炎

6、性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明糖尿病大鼠出現(xiàn)了明顯的肝損傷。2生化指標(biāo)顯示：與C組相比，M組大鼠體重、肝臟重量明顯減低（P＜0.05），而血糖、ALT、AST、TC、TG、
　　LDL明顯升高（P＜0.05）。參芍口服液治療各組，以上各項(xiàng)生化指標(biāo)均有所改善，其中T-H組大鼠體重、肝臟重量顯著增加，血糖、ALT、AST、TC、TG、LDL明顯降低（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 HE染色結(jié)果顯示：與C組相比，M組肝細(xì)胞彌漫性腫脹，水樣變性

7、，伴有散在點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死，肝竇狹窄甚至閉塞，核染色變淺或核消失，核被擠壓到一側(cè)，可見(jiàn)雙核，匯管區(qū)周圍可見(jiàn)纖維組織增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。經(jīng)參芍口服液干預(yù)后，T-L組肝細(xì)胞水腫、水樣變性，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所好轉(zhuǎn)，T-M組肝損傷進(jìn)一步減輕，竇間隙增寬，T-H組未見(jiàn)肝細(xì)胞水腫，竇間隙正常，匯管區(qū)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。4 Masson染色結(jié)果顯示：與C組相比 M組大鼠肝組織中可見(jiàn)大量粗大的藍(lán)色膠原纖維，沉積在血管、匯管區(qū)及狄氏間隙等處。參芍口服液干預(yù)

8、組中：T-L組與M組相比變化程度不明顯，仍可見(jiàn)較粗大的膠原纖維沉積，T-M組藍(lán)色膠原纖維明顯減少，膠原纖維變細(xì)，而T-H組僅見(jiàn)極少量藍(lán)色膠原纖維，接近于正常對(duì)照組。5免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：TLR-4蛋白主要表達(dá)于肝細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒沉著。與C組相比，M組黃色顆粒的沉積明顯增多。T-L組黃色顆粒的沉積有所減少，但不明顯， T-M組和T-H組黃色顆粒的沉積都有明顯的減少，其中以T-H組效果最明顯。同時(shí)，可以觀察到NF-ΚB、TGF-β

9、1、MMP-9、IL-6具有相似的表達(dá)情況：C組幾乎無(wú)表達(dá)，M表達(dá)明顯增多，T-L組表達(dá)有所減少，T-M組表達(dá)明顯減少，T-H組僅有少量表達(dá)。6 Western blot結(jié)果顯示：與C組相比，M組肝組織中TLR-4、NF-ΚB、TGF-β1、MMP-9、IL-6蛋白的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。參芍口服液治療各組中，T-L組TLR-4、TGF-β1、IL-6蛋白的表達(dá)較模型組有所減少（P＜0.05），而NF-ΚB、MMP-9雖也有下降

10、趨勢(shì)，但無(wú)顯著意義；T-M組TLR-4、NF-ΚB、TGF-β1、IL-6蛋白的表達(dá)較模型組明顯減少（P＜0.05），但MMP-9的表達(dá)與模型組相比仍無(wú)顯著差異；T-H組TLR-4、NF-ΚB、TGF-β1、MMP-9、IL-6蛋白的表達(dá)較模型組降低最顯著（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1參芍口服液對(duì)糖尿病肝損害有保護(hù)作用，并在125mg/kg、250mg/kg、500 mg/kg范圍內(nèi)存在一定的劑量依賴關(guān)系；2參芍口服液對(duì)糖尿病肝