基于綠色溶劑的磁性固相萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用研究.pdf

1、磁性固相萃取技術(shù)(Magnetic Solid Phase Extraction，MSPE)是以磁性材料作為吸附劑的一種分散固相萃取技術(shù)，該技術(shù)的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)合成功能化的吸附劑。作為新型綠色溶劑的低共熔溶劑(Deep Eutectic Solvent，DES)和離子液體(IonicLiquid，IL)具有結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)性和易功能化的優(yōu)點(diǎn)，固定至磁性顆粒上將得到負(fù)載型低共熔溶劑或負(fù)載型離子液體，將其作為磁性固相萃取技術(shù)的吸附劑，可以充分發(fā)揮低共

2、熔溶劑或離子液體和磁性顆粒兩者的優(yōu)勢(shì)。因而，與低共熔溶劑或離子液體相結(jié)合，磁性固相萃取技術(shù)將會(huì)得到更為廣闊的應(yīng)用。
　　本研究設(shè)計(jì)合成兩類綠色溶劑——低共熔溶劑和離子液體，結(jié)合磁性固相萃取技術(shù)，建立了萃取分離蛋白質(zhì)的方法。主要內(nèi)容如下:
　　(1)氯化膽堿類低共熔溶劑修飾的磁性氧化石墨烯固相萃取蛋白質(zhì)
　　首先合成四種氯化膽堿類低共熔溶劑(DES)，用來(lái)修飾磁性氧化石墨烯(Fe3O4@GO)合成Fe3O4@GO-DES

3、復(fù)合物，再用于蛋白質(zhì)的磁性固相萃取。用X-射線衍射儀、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)、傅里葉變換紅外光譜儀、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、熱重分析儀對(duì)Fe3O4@GO-DES進(jìn)行表征。以牛血清白蛋白(BSA)為研究對(duì)象，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察了低共熔溶劑的種類、萃取溫度、溶液離子強(qiáng)度、萃取時(shí)間、蛋白質(zhì)濃度和Fe3O4@GO-DES加入量對(duì)萃取容量的影響。在最佳萃取條件下，萃取容量可達(dá)100.2 mg/g。萃取之后，選擇0.005 mol/L Na2HPO4-1 m

4、ol/L NaCl的水溶液作為洗脫液對(duì)含BSA的萃取劑進(jìn)行洗脫，洗脫率可達(dá)90.9％。用圓二色譜儀(CD)測(cè)定了洗脫所得BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明其二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生改變。另外，實(shí)驗(yàn)還將所提出的Fe3O4@GO-DES-MSPE技術(shù)應(yīng)用于卵清蛋白(OVA)、溶菌酶(Lys)和牛血紅蛋白(BHb)的萃取。所擬方法為蛋白質(zhì)的分離純化提供了一種新思路。
　　(2)甜菜堿類離子液體修飾的磁性顆粒固相萃取蛋白質(zhì)
　　采用共沉淀法制備了F

5、e3O4，用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)對(duì)Fe3O4進(jìn)行修飾得到Fe3O4/APTES顆粒，再通過(guò)靜電相互作用使其與GO結(jié)合形成磁性氧化石墨烯(Fe3O4/APTES/GO)。用所合成的甜菜堿類離子液體修飾Fe3O4/APTES/GO顆粒得到Fe3O4/APTES/GO/IL，并將其應(yīng)用于牛血清白蛋白(BSA)的萃取。用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)、X-射線衍射儀、傅里葉變換紅外光譜儀、熱重分析儀、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、Zet

6、a電位分析儀對(duì)Fe3O4/APTES/GO/IL進(jìn)行表征。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察了離子液體種類、萃取溫度、萃取時(shí)間、BSA濃度、溶液離子強(qiáng)度和溶液pH值對(duì)萃取容量的影響。在最佳萃取條件下，萃取容量可達(dá)139.1 mg/g。對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)e3O4/APTES/GO/IL對(duì)BSA的萃取能力明顯大于裸露Fe3O4納米顆粒以及Fe3O4/APTES/GO對(duì)BSA的萃取能力。以0.8 mol/L K2HPO4-1 mol/L NaCl的水溶液作為洗

7、脫液對(duì)含有BSA的萃取劑進(jìn)行洗脫，洗脫率可達(dá)95.5％。圓二色譜儀測(cè)定結(jié)果表明洗脫所得BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)還將小牛全血作為實(shí)際樣品，考察了Fe3O4/APTES/GO/IL在實(shí)際應(yīng)用中的萃取性能，結(jié)果令人滿意。
　　(3)聚合離子液體修飾的磁性顆粒固相萃取胰蛋白酶
　　以一種陰離子含有不飽和鍵的離子液體為單體，通過(guò)共價(jià)鍵合的方法在3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷（γ-MPS）修飾的磁性Fe3O4顆粒（Fe3

8、O4/SiO2/γ-MPS）表面接枝離子液體聚合物(PIL)，得到負(fù)載型聚合離子液體（Fe3O4/SiO2/γ-MPS/PIL）。用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)、X-射線衍射儀、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、熱重分析儀、Zeta電位分析儀對(duì)Fe3O4/SiO2/γ-MPS/PIL進(jìn)行表征。以Fe3O4/SiO2/γ-MPS/PIL為磁性固相萃取劑，胰蛋白酶（Try）為研究對(duì)象，進(jìn)行了一系列的單因素萃取研究。在最佳萃取條件下，萃取容量可達(dá)