出芽短梗霉高效合成普魯蘭的發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、普魯蘭(pullulan)是一種由出芽短梗霉合成的微生物胞外多糖。作為一種化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特的水溶性高分子聚合物，普魯蘭具有良好的可塑性、成膜性和穩(wěn)定性，因而可以安全地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)保和輕工等諸多領(lǐng)域。利用出芽短梗霉細(xì)胞好氧發(fā)酵合成普魯蘭是目前該多糖生產(chǎn)的主要方法。雖然已有大量提高普魯蘭發(fā)酵產(chǎn)量和分子量的研究報(bào)道，但是針對(duì)出芽短梗霉生物合成普魯蘭過(guò)程中蘊(yùn)含的生理生化機(jī)制研究才剛剛開(kāi)始。本論文以一株不產(chǎn)色素的出芽短梗霉(Aureobasi

2、dium pullulans CCTCC M2012259)為實(shí)驗(yàn)菌株，以實(shí)現(xiàn)普魯蘭的高產(chǎn)量和/或高分子量以及降低原料成本為目標(biāo)，采用一系列發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化策略對(duì)普魯蘭分批發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。從影響普魯蘭分批發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素入手，探討了有利于普魯蘭高效合成的內(nèi)在生理生化機(jī)制，并對(duì)發(fā)酵過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性進(jìn)行分析，主要研究結(jié)果如下:
　　1.分別考察了發(fā)酵培養(yǎng)基中不同濃度硫酸銨和酵母粉對(duì)普魯蘭產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)氮源限制可以提高普魯蘭的產(chǎn)量。當(dāng)硫

3、酸銨和酵母粉的濃度分別為0.3 g/L和1.5 g/L時(shí)，普魯蘭產(chǎn)量在66 h時(shí)達(dá)到最大值25.3 g/L，比不限氮時(shí)提高了14.0％。相關(guān)生理生化指標(biāo)顯示，限氮條件提高了PGM和FKS酶活，上調(diào)了pgm1和fks基因的轉(zhuǎn)錄水平，增加了胞內(nèi)ATP含量和ATP/ADP比率，為普魯蘭的過(guò)量合成提供了充足的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。在普魯蘭分批發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)用限氮補(bǔ)碳策略，在36h補(bǔ)加葡萄糖至總糖濃度為70 g/L，最終在72 h時(shí)普魯蘭產(chǎn)量為39.8

4、g/L，比不限氮補(bǔ)糖下的結(jié)果高出16.0％。發(fā)酵過(guò)程經(jīng)濟(jì)性分析結(jié)果表明，限氮補(bǔ)碳使普魯蘭合成的原料成本明顯下降。
　　2.在5L發(fā)酵罐中考察了不同恒定攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)普魯蘭分批發(fā)酵的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最適合出芽短梗霉細(xì)胞生長(zhǎng)和獲得最大Mw的轉(zhuǎn)速是500rpm，而最有利于普魯蘭合成和最終Mw的轉(zhuǎn)速是400rpm。通過(guò)分析普魯蘭分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)，測(cè)定FKS和普魯蘭降解酶等關(guān)鍵酶的活性，結(jié)合胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)水平和比率的變化規(guī)律，以高分子量普魯蘭

5、的高產(chǎn)為目標(biāo)，提出了兩階段攪拌轉(zhuǎn)速控制策略，即在分批發(fā)酵的開(kāi)始階段將轉(zhuǎn)速控制在500 rpm，18h時(shí)將轉(zhuǎn)速切換至400rpm并維持至發(fā)酵結(jié)束。在此兩階段攪拌轉(zhuǎn)速控制策略下，普魯蘭的最終分子量為3.09×106 Da;普魯蘭產(chǎn)量為27.4 g/L，比恒定轉(zhuǎn)速400 rpm扣500 rpm下產(chǎn)量分別提高了13.7％和17.6％。
　　3.考察NaCl對(duì)出芽短梗霉生物合成普魯蘭的影響，與培養(yǎng)基中不添加NaCl的對(duì)照相比，NaCl提高了

6、普魯蘭的產(chǎn)量，但降低了普魯蘭的分子量。當(dāng)NaCl濃度為3g/L時(shí)，普魯蘭的產(chǎn)量為28.9 g/L，比對(duì)照提高了26.7％，但分子量在72 h時(shí)只是對(duì)照的47.0％。分別測(cè)定了普魯蘭合成和降解過(guò)程中關(guān)鍵酶的酶活，結(jié)果表明NaCl的存在提高了分批發(fā)酵前期FKS的活力，也提高了發(fā)酵后期普魯蘭降解酶的活力。對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組樣本進(jìn)行測(cè)序和分析，結(jié)果顯示當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl濃度為3g/L時(shí)，有77個(gè)基因在實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)，其中包括pgm1

7、和fks，只有2個(gè)基因在實(shí)驗(yàn)組中低表達(dá)。通過(guò)對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路注釋分析，發(fā)現(xiàn)NaCl的添加提高了普魯蘭合成、分泌和水解相關(guān)酶以及能量合成酶相關(guān)基因的表達(dá)，部分解釋了NaCl促進(jìn)普魯蘭合成但也降低了普魯蘭分子量的內(nèi)在原因。
　　4.在搖瓶水平上證實(shí)了稻殼水解液可以用作碳源培養(yǎng)出芽短梗霉細(xì)胞并合成普魯蘭，但是普魯蘭產(chǎn)量明顯低于葡萄糖或木糖作為單一碳源發(fā)酵結(jié)果。通過(guò)對(duì)不同預(yù)處理方式下的稻殼水解液中的抑制物成

8、分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)并經(jīng)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證實(shí)了乙酸是抑制普魯蘭合成的主要因素。為了降低普魯蘭合成酶乙酸的敏感性，在含有未經(jīng)任何處理的稻殼水解液的培養(yǎng)基平板上，逐漸提高稻殼水解液的含量，采用適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行馴化，選育獲得了一株能夠適應(yīng)乙酸環(huán)境的突變株A.pullulansARH-1。與出發(fā)菌株相比，該突變株具有更高的利用稻殼水解液合成普魯蘭的生產(chǎn)效率，酶活分析結(jié)果證明了突變株細(xì)胞解除了乙酸對(duì)普魯蘭合成酶活性的抑制。
　　5.在考

9、察了玉米漿粉和豆粕水解液替代酵母粉用于普魯蘭生物合成可行性的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法分別對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸銨與玉米漿粉及豆粕水解液的含量和比例進(jìn)行優(yōu)化。以普魯蘭高產(chǎn)為目標(biāo)，得到最佳的混合氮源組合分別為1.28 g/L硫酸銨和4.68 g/L玉米漿粉，以及1.25 g/L硫酸銨和12.41 mL/L豆粕水解液。5L發(fā)酵罐中的普魯蘭分批發(fā)酵結(jié)果顯示出芽短梗霉利用玉米漿粉合成的普魯蘭分子量與酵母粉大體相當(dāng)，但產(chǎn)量降低14.4％;利用豆粕水解液