林蘭教授辨治糖尿病周圍神經病變的臨床經驗挖掘及相關機制研究.pdf

1、糖尿病周圍神經病變是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，該病可嚴重影響患者的生存質量、增加糖尿病患者的致殘率和死亡率。目前該病的發(fā)病機制尚不明確，針對該病的有效防治藥物也非常有限。林蘭教授對糖尿病及其并發(fā)癥的防治研究已達50年，她對糖尿病周圍神經病變的中醫(yī)病因病理、治療等方面認識非常深刻，創(chuàng)造出了許多獨特有效的治療方法，糖痛方就是其防治糖尿病周圍神經病變的臨床精華之一。本論文在導師林蘭教授“糖尿病三型辨證理論”學術思想的指導下，首先對其防治糖

2、尿病周圍神經病變的中醫(yī)辨證論治經驗進行了系統(tǒng)的挖掘和整理，然后以體外培養(yǎng)的雪旺細胞作為研究對象，采用中藥血清藥理學方法，從細胞凋亡的信號傳導通路探討糖痛方治療糖尿病周圍神經病變的可能分子機制。
　　一、臨床研究
　　目的:對林蘭教授治療糖尿病周圍神經病變的臨床病例進行數(shù)據(jù)挖掘分析，總結林蘭教授對糖尿病周圍神經病變的中醫(yī)病因病機認識及其辨證分型和方、藥應用特點。為提高林蘭教授經驗傳承研究的效率及水平，為總結、提煉和優(yōu)化糖尿病周

3、圍神經病變中醫(yī)藥防治規(guī)律提供臨床循證依據(jù)。
　　方法:將2011年1月-2014年1月林蘭教授在廣安門醫(yī)院內分泌門診確診的105例糖尿病周圍神經病變患者的470診次的診療病例整理成結構化臨床診療電子病歷。將電子病歷、評分量表、檢查化驗結果、方藥的全部數(shù)據(jù)導入數(shù)據(jù)倉庫，利用多維檢索分析平臺進行分析。統(tǒng)計分析DPN患者的一般資料、理化檢查結果、癥狀和證型特點、林蘭教授用藥特點。
　　結果:1、DPN患者一般資料統(tǒng)計:105例DP

4、N患者中男性占52.4％、女性占47.6％;無家族史的占77.1％、有家族史的占22.9％;年齡小于50歲的占14.3％、50-59歲的占32.4％、60-69歲的占28.6％、大于70歲的占24.8％;糖尿病病程小于1年的占3.8％、1-10年的占59.2％、11-20年的占30％、大于20年的占6.7％。2、患者癥狀分析:將患者各個癥狀按照出現(xiàn)的頻次統(tǒng)計。結果顯示，下肢的感覺和運動異常癥狀中肢體麻木癥狀出現(xiàn)的最多，其次為肢體發(fā)涼、肢

5、體疼痛、肢體浮腫，而肢體強急或癱軟無力癥狀出現(xiàn)的最少。從其他癥狀和舌脈證出現(xiàn)的頻次分析，屬于血瘀證、氣虛證的癥狀出現(xiàn)的最多，陰虛和陽虛癥狀出現(xiàn)的頻次居中，熱盛的癥狀出現(xiàn)的最少。3、DPN患者證候要素提取的分析:以單一癥狀分析，DPN各類證候中以氣虛證、陽虛證、陰虛證最為常見，瘀血證、痰濕證、熱盛證其次。但各證型之間常常相互組合出現(xiàn)，在二證、三證、四證組合中可以看出，出現(xiàn)頻次最多的是氣陰兩虛證，而且在氣陰兩虛基礎上，氣陰兩虛夾瘀證要多于氣

6、陰兩虛夾痰濕證;陰陽兩虛證其次，在陰陽兩虛的基礎上，陰陽兩虛夾痰濕證要多于陰陽兩虛夾瘀血證;陰虛熱盛證出現(xiàn)的最少，而且陰虛熱盛夾痰濕證和瘀血證出現(xiàn)的頻次均少于10次。依據(jù)數(shù)據(jù)挖掘結果推斷DPN的臨床主要證候類型是氣陰兩虛夾瘀證和陰陽兩虛夾痰濕證。4、林蘭教授臨床用藥分析:匯總林蘭教授治療的105例DPN患者、470個診次中使用的所有中藥處方，將處方中所有中藥按照藥物出現(xiàn)的總頻次數(shù)進行排序，統(tǒng)計用藥頻次超過10次的藥物作為高頻中藥，共選取

7、中藥69味。參考第七版《中藥學》教材及《中華本草》，將69味高頻中藥按照功效進行分類，統(tǒng)計結果顯示，林蘭教授治療DPN使用最多的是補虛藥、活血化瘀藥，其次為安神藥、收澀藥、理氣藥、化痰藥、化濕藥、平肝熄風藥、清熱藥。在補虛類藥物使用時以補血藥和補氣藥為主，補陰藥和補陽藥為次。將69味高頻中藥按照藥物的歸經進行分類，結果顯示林蘭教授治療DPN使用的藥物中歸心經的藥物最多，其次為肝經、腎經、肺經、脾經、胃經、大腸經、膽經、膀胱經、心包經、小

8、腸經、三焦經。5、采用Liquorice數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)對高頻中藥，進行基于功效的聚類分析，統(tǒng)計出了林蘭教授治療DPN的組方配伍規(guī)律，即核心復方配伍規(guī)律和常用的藥對配伍規(guī)律。
　　結論:糖尿病三型辨證理論是臨床辨治糖尿病及其并發(fā)癥的核心理論基礎，糖尿病周圍神經病變的辨證論治是在三型辨證理論指導下的擴展和延伸。氣陰兩虛是糖尿病周圍神經病變的發(fā)病基礎，陰陽兩虛是病情加重的重要原因;瘀血、痰、濕是主要致病因素，該病病變涉及五臟系統(tǒng)，癥狀表現(xiàn)

9、復雜，根據(jù)臨床癥狀特點可將糖尿病周圍神經病變分為四型:氣陰兩虛脈絡瘀阻型、陰陽兩虛寒濕痹阻型、肝腎陰虛血不榮經型、脾胃兩虛痰瘀互阻型。本課題首次利用結構化臨床診療信息采集系統(tǒng)，最大程度地收集到全面、規(guī)范的病例資料，從“病—癥—證—治—方—藥”等各個角度對林蘭教授治療糖尿病周圍神經病變的臨床經驗進行分析，總結出了林蘭教授對糖尿病周圍神經病變的中醫(yī)病因病機認識及其辨證分型和方、藥應用特點。為名老中醫(yī)經驗的繼承和發(fā)揚提供了一定的借鑒。

10、　　二、實驗研究
　　目的:從細胞凋亡的信號傳導通路探討糖痛方治療糖尿病周圍神經病變的分子機制。
　　方法:本課題從SD乳鼠的坐骨神經中培養(yǎng)出雪旺細胞，并使用含50mM高糖的培養(yǎng)液干預72h，誘導出雪旺細胞的凋亡模型。采用cck-8法篩選出糖痛方含藥血清、糖痛方中的主要有效成分鹽酸川芎嗪、黃芪多糖，促進雪旺細胞增殖的最佳濃度，作為干預雪旺細胞凋亡的藥物濃度。實驗共設立對照組、高糖組、糖痛方組、川芎嗪組、黃芪多糖組5個組別，分

11、別采用AⅤ/PI雙染法觀察各組細胞凋亡率、用TUNE1免疫熒光染色法觀察凋亡細胞形態(tài)、用WesternBlot法以及RT-PCR法觀察凋亡相關基因與因子(bcl-2、bax、Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome C、Fas、FasL、ICAM-1)蛋白和mRNA表達的變化。從多方面觀察、比較中藥糖痛方及其主要有效成分對高糖誘導的雪旺細胞凋亡的干預作用。
　　結果:1、本實驗采用組織塊培養(yǎng)法、差速貼壁法、低濃

12、度胰酶消化法相結合，培養(yǎng)出了純度達85％的原代雪旺細胞。實踐證明該方法培養(yǎng)出的原代雪旺細胞，不僅純度高、活性好而且可重復性佳，為后續(xù)的實驗研究奠定了基礎。2、本實驗采用AnnexinⅤ/PI雙染、流式細胞儀檢測法觀察出不同高糖濃度、不同干預時間以及不同細胞培養(yǎng)密度條件下的雪旺細胞凋亡情況，經過多次重復實驗，最終確定以50mM的高糖干預的第48-72h作為雪旺細胞凋亡模型最適宜。3、采用CCK-8法證實了糖痛方含藥血清對高糖導致的雪旺細胞

13、增殖抑制狀態(tài)有顯著的逆轉作用。糖痛方藥物的主要有效成分:黃芪多糖在160mg/L-3200mg/L濃度之間、鹽酸川芎嗪在4mg/L-200mg/L濃度之間時具有明顯促進雪旺細胞增殖的作用，并且其增殖作用隨時間的延長而增強。隨后我們在兩種藥物的有效濃度中各選取了高、中、低三個干預濃度，將其作用于高糖培養(yǎng)的雪旺細胞，實驗結果進一步證明鹽酸川芎嗪和黃芪多糖有促進雪旺細胞的增殖作用，而且這種作用也可以明顯改善高糖對雪旺細胞增殖的抑制作用。4、通

14、過AnnexinⅤ/PI雙染法、TUNE1免疫熒光染色法檢測了糖痛方及其主要有效成分對高糖誘導的雪旺細胞凋亡的影響，結果顯示，經高糖作用72h后雪旺細胞發(fā)生明顯凋亡，與對照組相比高糖組和川芎嗪組凋亡最顯著(P＜0.05)，黃芪多糖組、糖痛方組的凋亡率與對照組相比均增加，與高糖組相比均有顯著降低(P＜0.05)。糖痛方組與黃芪多糖組相比無顯著差異，與川芎嗪組相比差異顯著(P＜0.05)。5、Western Blot法檢測結果顯示，各干預組

15、的bcl-2/bax的比值與對照組相比均顯著降低(P＜0.01)，這表明對照組細胞分泌的抗凋亡蛋白占主導，對細胞有保護作用，而其余各干預組經高糖干預后促凋亡的蛋白過度表達，從而導致細胞凋亡發(fā)生。經高糖刺激后各干預組Fas、FasL、CytochromeC、Caspase-9、Caspase-3、ICAM-1蛋白表達量均增加，其中高糖組增加最明顯，與對照組相比（P＜0.01或P＜0.05），糖痛方組增加最少，川芎嗪組和黃芪多糖組介于兩者之

16、間。6、RT-PCR法檢測結果顯示，糖痛方組各種凋亡相關基因和因子的mRNA表達量與對照組相比均無明顯差異;高糖組與對照組相比bcl-2mRNA表達量顯著降低(P＜0.01)，bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-3、ICAM-1mRNA表達量顯著增高(P＜0.01);川芎嗪組和黃芪多糖組各凋亡相關基因和因子的mRNA表達量介于高糖組和糖痛方組之間。
　　結論:以益氣養(yǎng)陰活血化瘀為主要作用的糖痛方能