淀粉液化芽孢桿菌ES-2抗菌脂肽生產(chǎn)工藝的研究.pdf

1、抗菌脂肽是芽孢桿菌屬產(chǎn)生的微生物來源的抗菌肽，具有抗細菌、真菌、病毒和支原體的功能。由于抗菌脂肽高效、無毒，使得在生物醫(yī)藥方面具有重要的應(yīng)用價值。此外，脂肽作為一種生物表面活性劑在石油工業(yè)、食品、化妝品和農(nóng)業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用價值。
　　 近幾年來，本實驗室篩選到一株植物內(nèi)生菌菌株Bacillus amyloliquefaciens ES-2，該菌株產(chǎn)生的抗微生物活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性和部分酶穩(wěn)定性，抗菌譜廣，抗微生物活性高。

2、前期研究表明該微生物活性物質(zhì)主要為surfactin和fengycin，均為環(huán)狀脂肽。
　　 為了實現(xiàn)抗菌脂肽的工業(yè)化，急需解決發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫問題以及確定簡單可行的生產(chǎn)工藝。因此本研究從消泡劑出發(fā)，研究消泡劑消泡的可能性，同時研究提取純化抗菌脂肽的方法，最后對溶氧對發(fā)酵的影響進行了初步的研究，得出以下研究結(jié)果：
　　 1.將大豆油、有機硅消泡劑和聚醚類消泡劑三種消泡劑分別用于Bacillusamyloliquefa

3、ciens ES-2抗菌脂肽發(fā)酵，研究表明三種消泡劑均可以實現(xiàn)消泡和抑泡，其中大豆油和有機硅消泡劑表現(xiàn)出更好的消泡性能和抑泡性能。以大豆油和聚醚類消泡劑為消泡劑的發(fā)酵液的菌體含量高于不添加消泡劑的發(fā)酵液.。其中以聚醚為消泡劑的發(fā)酵液的菌體干重增大的最多，發(fā)酵24h時其菌體干重為對照的2.14倍。以大豆油和聚醚類消泡劑為消泡劑的發(fā)酵液中抗菌脂肽的含量相對于不加消泡劑下的發(fā)酵有了很大的提高，其中大豆油帶來的產(chǎn)量的增加尤其明顯，脂肽達到了24

4、97.67mg/L。
　　 2.在抗菌脂肽的提取中，大豆油的加入有利于抗菌脂肽的酸沉提取，酸沉提取率達到了92.29％。以大豆油為消泡劑的發(fā)酵得到的抗菌脂肽更容易使用甲醇和乙醇提取出來，提取率達到了很高水平，并且其產(chǎn)品純度也略高于不加消泡劑發(fā)酵提取到的抗菌脂肽產(chǎn)品純度，因此可以確定大豆油為適合抗菌脂肽發(fā)酵的消泡劑。選擇硅藻土過濾的方法獲得酸沉后的絮凝物，并選擇乙醇對做有機溶劑提取，乙醇用量跟發(fā)酵液總量的體積比為1:2.5時抗菌脂

5、肽提取率達到了88.72％。
　　 3.對抗菌脂肽粗提物進行了大孔樹脂吸附純化研究，結(jié)果表明X-5大孔樹脂在靜態(tài)吸附中表現(xiàn)出優(yōu)秀的對抗菌脂肽的吸附能力，吸附量達到了57.73 mg·g-1，吸附率達到了85.05％，在解吸結(jié)果中，解析率達到了65.59％，綜合吸附和解吸效果，選擇X-5大孔樹脂作為研究吸附純化的材料。經(jīng)過動態(tài)吸附初步研究結(jié)果表明經(jīng)過吸附純化抗菌脂肽純度達到了72.86％，相對原粗提物的純度有了較大的提高，因此可以

6、選擇大孔樹脂吸附作為提高抗菌脂肽純度的方法。純化采用100％乙醇洗脫，純化的工藝參數(shù)為：上樣濃度14.4mg/mL、上樣速率1mL/min，洗脫速率2 mL/min、洗脫劑用量2.5BV，產(chǎn)品的回收率達90.01％，純度達74.4％。
　　 4.試驗通過溶氧電極觀察記錄發(fā)酵過程中的溶氧變化，結(jié)果顯示發(fā)酵6h后溶氧開始下降，并且下降幅度逐漸增大，到18h時溶氧為0.6％，溶氧達到了一個非常低的水平，并維持此低溶氧水平至發(fā)酵結(jié)束。為

7、研究溶氧對發(fā)酵的影響，采用三種溶氧控制方案對抗菌脂肽的發(fā)酵進行控制，經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵全過程保持溶氧水平在5％以上時，菌體濃度、細胞比生長速率和細胞生產(chǎn)強度均得到了提高，但是抗菌脂肽產(chǎn)量、產(chǎn)物比合成速率和產(chǎn)物生產(chǎn)強度均下降。在發(fā)酵后期即菌體生長進入穩(wěn)定期后提高溶氧水平在5％以上時，菌體生長相對正常發(fā)酵沒有變化，而抗菌脂肽產(chǎn)量、產(chǎn)物比合成速率和產(chǎn)物生產(chǎn)強度均上升。因此可以說明溶氧在抗菌脂肽發(fā)酵過程中是調(diào)整菌體生長和產(chǎn)物合成代謝的重要因素。