海洋源解淀粉芽孢桿菌細(xì)菌素CAMT2發(fā)酵優(yōu)化、分離及抗菌機(jī)理研究.pdf

1、細(xì)菌素 CAMT2是分離自海洋寶石石斑魚(yú)腸道的解淀粉芽孢桿菌 ZJHD-06(Bacillus amyloliquefaciens ZJHD-06)產(chǎn)生的一種抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性強(qiáng)的肽類(lèi)物質(zhì)。本課題通過(guò)對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素CAMT2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化獲得高抗菌活性發(fā)酵液,并對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行一系列的分離純化,獲得一定純度的細(xì)菌素CAMT2,最后對(duì)分離純化的細(xì)菌素CAMT2進(jìn)行抗菌機(jī)理研究。研究結(jié)果如下:
　　(1)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)細(xì)菌

2、素 CAMT2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化:以抑制彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)的效價(jià)為抗菌活性評(píng)價(jià)指標(biāo),以從7種培養(yǎng)基中篩選出的TGE培養(yǎng)基作為發(fā)酵優(yōu)化的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,對(duì)選擇的16個(gè)因素設(shè)計(jì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn),篩選出葡萄糖、FeSO4、Vc3個(gè)主效因素,再通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)分別確定7.00 g/L、0.09 mg/L、0.65 g/L作為中心水平,并設(shè)計(jì)了Box-Behnken實(shí)驗(yàn)。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用JMP軟件分析得出

3、最佳配比,即葡萄糖7.15 g/L、FeSO40.11 mg/L、Vc0.69 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、酵母膏10.0 g/L;通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí),優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)發(fā)酵上清液的抗菌效價(jià)是原始TGE培養(yǎng)基的2.1倍。
　　(2)解淀粉芽孢桿菌細(xì)菌素CAMT2分離純化:細(xì)菌素CAMT2分離純化分為硫酸銨沉淀、SephadexG-50柱層析、SDS-PAGE電泳、蛋白膠條鑒定4個(gè)步驟。通過(guò)20％~80%飽和度的硫酸銨沉淀實(shí)

4、驗(yàn),確定了發(fā)酵上清液最佳沉淀飽和度為60%。沉淀的蛋白用磷酸緩沖液溶解、透析后過(guò)SephadexG-50柱,洗脫液為0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液,對(duì)每管收集液在吸收波長(zhǎng)275 nm下檢測(cè)吸收值,并繪制洗脫曲線。洗脫曲線表現(xiàn)出兩個(gè)洗脫峰,檢測(cè)第一個(gè)峰收集液(F1)和第二峰收集液(F2)的抗菌活性后發(fā)現(xiàn)F1無(wú)抗菌活性,F2抗菌活性明顯。F2收集液用超純水透析后真空冷凍干燥,干燥后粉末用磷酸緩沖液溶解并進(jìn)行SDS-PAGE電泳,

5、結(jié)果顯示僅有分子量約20 kDa的一條蛋白條帶。將這一蛋白條帶經(jīng)處理后交于華大基因(BGI)進(jìn)行全質(zhì)譜分析及蛋白鑒定,鑒定結(jié)果表明存在5種蛋白,經(jīng)過(guò)比對(duì)和分析得知分子量為19608.57 Da、N末端氨基酸序列為MKIARTAIGSCLALSLTIPF的2號(hào)蛋白和分子量為20265.57 Da、N末端氨基酸序列為MKKWLLFLTTITLILSLGTA的3號(hào)蛋白為分離的目的蛋白。
　　(3)解淀粉芽孢桿菌細(xì)菌素CAMT2抗菌機(jī)理研

6、究:實(shí)驗(yàn)從對(duì)Bacillus flexus的生長(zhǎng)抑制狀況、細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞膜通透性的影響三個(gè)方面探討細(xì)菌素CAMT2的抗菌機(jī)理。通過(guò)繪制Bacillus flexus的生長(zhǎng)抑制曲線發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素CAMT2對(duì)Bacillus flexus的生長(zhǎng)抑制作用明顯,并且出現(xiàn)部分溶菌現(xiàn)象;運(yùn)用掃描電鏡觀察到被作用前后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化,作用后的細(xì)胞兩端變尖,細(xì)胞邊緣成鋸齒狀,部分細(xì)胞破裂;在對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響方面,實(shí)驗(yàn)測(cè)定了電導(dǎo)率、胞內(nèi)外K+濃