RPS14基因過(guò)表達(dá)對(duì)人MDS細(xì)胞株MUTZ-8增殖的影響.pdf

1、目的：骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndrome，MDS)是累及造血干細(xì)胞的異質(zhì)性克隆性疾病，以無(wú)效造血及高風(fēng)險(xiǎn)向急性白血病轉(zhuǎn)化為特征。目前本病預(yù)后差，缺乏有效的治療手段。因此，探索MDS的分子發(fā)病機(jī)制，對(duì)改善MDS的預(yù)后具有重要意義。5號(hào)染色體長(zhǎng)臂缺失是MDS普遍存在的染色體異常之一，研究發(fā)現(xiàn)缺失的區(qū)域均包括5q31-5q32，該區(qū)域稱為共缺失區(qū)域(common deleted region，CDR)。RPS

2、14(ribosomal protein S14，RPS14)基因位于該區(qū)域，表達(dá)量明顯下降。我們的前期研究已經(jīng)表明，伴del(5q-)MDS患者體內(nèi)RPS14基因表達(dá)水平下降，RPS14在MDS的發(fā)病發(fā)展中起著很重要的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建攜帶人RPS14基因的重組慢病毒載體pGC-FURPS14-GFP，并將構(gòu)建成功的重組慢病毒載體感染人MDS細(xì)胞株MUTZ-8細(xì)胞，增高目的基因在靶細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，再通過(guò)細(xì)胞毒力實(shí)驗(yàn)、凋

3、亡率的變化來(lái)觀察RPS14表達(dá)水平增高后對(duì)MUTZ-8細(xì)胞增殖、凋亡的影響。
　　方法：
　　1、攜帶人RPS14基因的重組慢病毒載體pGC-FU RPS14-GFP的構(gòu)建及鑒定：選用慢病毒pGC-FU-EGFP為載體，首先設(shè)計(jì)合成RPS14 PCR產(chǎn)物與線性化慢病毒載體相連接，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定確認(rèn)，與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染2933、細(xì)胞，產(chǎn)生重組慢病毒載體pGC-FU RPS14-GFP，逐孔稀釋法測(cè)定病毒滴度；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)感

4、染效率，RT-PCR及Westernblot檢測(cè)感染前后目的細(xì)胞內(nèi)RPS14 mRNA及RPS14蛋白的表達(dá)變化。
　　2、重組慢病毒載體pGC-FU RPS14-GFP感染MUTZ-8細(xì)胞后對(duì)其增殖影響的研究：將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組為：未感染組(MUTZ-8)、空病毒感染組、感染組，應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定各組細(xì)胞的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　3、重組慢病毒載體pGC-FU RPS14-GFP感染MUTZ-8細(xì)胞后對(duì)其凋亡影響的

5、研究：將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組為：未感染組(MUTZ-8)、空病毒感染組、感染組，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1、本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組慢病毒載體pGC-FU RPS14-GFP，滴度達(dá)2.0×109Tu/ml，構(gòu)建的慢病毒載體能夠高效率的感染MUTZ-8細(xì)胞，100MOI的重組慢病毒載體對(duì)MUTZ-8細(xì)胞的感染效率約為(51.303±3.908)％，RT-PCR、Western blot檢測(cè)均顯示感染后目的細(xì)

6、胞RPS14 mRNA及蛋白的表達(dá)水平高于感染前。
　　2、重組慢病毒載體pGC-FU：RPS14-GFP感染MUTZ-8細(xì)胞后抑制其增殖：感染后2 d、3 d、4 d、5 d，收集各組細(xì)胞，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值，感染重組慢病毒載體后對(duì)MUTZ-8細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，與空病毒感染組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3、重組慢病毒載體pGC-FU RPS14-GFP感染MUTZ-8細(xì)胞后促進(jìn)其凋亡：流式

7、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染前后細(xì)胞的凋亡率變化，感染重組慢病毒載體后MUTZ-8細(xì)胞凋亡率為(26.233±3.095)％，顯著高于空病毒感染組細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、慢病毒載體可以高效率感染血液腫瘤細(xì)胞，對(duì)血液腫瘤的分子治療研究具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值；
　　2、RPS14基因表達(dá)水平增高抑制人MDS細(xì)胞株MUTZ-8細(xì)胞的增殖；
　　3、RPS14基因表達(dá)水平增高促進(jìn)人MDS細(xì)胞株MUTZ-8細(xì)