新型光學(xué)核酸探針的制備及其在生化分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、在生化分析研究中，核心是檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)與制備。光學(xué)核酸探針具有設(shè)計(jì)靈活、信號(hào)獲取方便、檢測(cè)靶標(biāo)廣泛、以及檢測(cè)策略豐富等優(yōu)良特性，吸引了研究者們的高度興趣，已經(jīng)成為分析研究工作中的重要工具。從光學(xué)核酸探針的結(jié)構(gòu)組成來看，信號(hào)單元的設(shè)計(jì)是最靈活、研究?jī)?nèi)容最豐富的部分，因此，合理設(shè)計(jì)與構(gòu)建信號(hào)單元一直是核酸探針發(fā)展的基礎(chǔ);其次，從光學(xué)核酸探針的發(fā)展歷程和趨勢(shì)來看，隨著科技的進(jìn)步，人們對(duì)分析研究工作的要求不斷上升，提高分析檢測(cè)方法的靈敏度一直是

2、研究者們追求的目標(biāo)之一;同時(shí)，構(gòu)建通用性、多功能檢測(cè)探針，實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)檢測(cè)也是核酸探針發(fā)展的一大趨勢(shì)。因此，本論文著眼于以信號(hào)單元的構(gòu)建為基礎(chǔ)、以信號(hào)放大技術(shù)的發(fā)展和多靶標(biāo)響應(yīng)探針的設(shè)計(jì)為目標(biāo)，制備可以應(yīng)用于生化分析的新型光學(xué)核酸探針。主要開展了以下研究工作:
　　一、Poly(T)穩(wěn)定的熒光銅納米顆粒的合成及其熒光性質(zhì)研究近年來，熒光金屬納米材料作為一類新型的納米信號(hào)單元在分析領(lǐng)域得到廣泛的研究和應(yīng)用。在本工作中，我們以發(fā)展一種合

3、成熒光銅納米顆粒(CuNPs)的新方法為目的，以生物分子單鏈DNA(ssDNA)作為模板穩(wěn)定劑去合成熒光CuNPs，系統(tǒng)地篩選了能夠作為模板分子去穩(wěn)定合成熒光CuNPs的ssDNA。我們發(fā)現(xiàn)，在含有還原劑抗壞血酸鈉的MOPS緩沖液中，聚胸腺嘧啶寡核苷酸(poly(T》能夠有效地穩(wěn)定熒光CuNPs的合成，而聚腺嘌呤寡核苷酸(poly(A))、聚胞嘧啶寡核苷酸(poly(C))、聚鳥嘌呤寡核苷酸(poly(G))、以及隨機(jī)的ssDNA序列不

4、能有效地穩(wěn)定該熒光納米材料的合成。該熒光CuNPs合成快速，具有大的斯托克斯位移(Stokes shifting)，其熒光強(qiáng)度對(duì)poly(T)聚合程度、poly(T)長(zhǎng)度、poly(T)濃度、以及銅離子濃度具有正相關(guān)性質(zhì)，較低的環(huán)境溫度、弱堿性緩沖液、以及適中的緩沖液離子強(qiáng)度有利于poly(T)穩(wěn)定的熒光銅納米顆粒的合成。因此，該發(fā)現(xiàn)為生化傳感提供了一種新的納米信號(hào)單元，同時(shí)，基于該CuNPs對(duì)ssDNA的序列依賴性，為ssDNA分子上

5、的位點(diǎn)選擇性礦化提供了新的材料和方法。
　　二、基于poly(T)穩(wěn)定的熒光銅納米顆粒和功能化的“水凝膠試紙”對(duì)銅離子的可視化便捷式檢測(cè)研究由于poly(T)穩(wěn)定的熒光CuNPs的信號(hào)對(duì)銅離子濃度具有高度依賴性，我們立足于發(fā)展一種可視化和便捷式的銅離子檢測(cè)方法。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種功能化的“水凝膠試紙”，poly(T)作為檢測(cè)探針與抗壞血酸鈉被包埋在水凝膠內(nèi)部，凝膠表面設(shè)計(jì)有進(jìn)樣微孔，通過移液槍將樣品滴加在微孔中，在紫

6、外燈照射下觀察和記錄檢測(cè)結(jié)果。該方法對(duì)銅離子的檢測(cè)具有很好的選擇性、檢測(cè)下限達(dá)到20μM。同時(shí)，該方法是一種“add-and-read”的模式，操作極其簡(jiǎn)單方便;使用試劑廉價(jià)，不需要對(duì)信號(hào)單元進(jìn)行復(fù)雜的合成，也不需要對(duì)核酸探針進(jìn)行繁瑣的標(biāo)記;基于微陣列功能化“水凝膠試紙”，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)信號(hào)的獲取;“水凝膠試紙”具有較好的時(shí)間穩(wěn)定性和功能恢復(fù)性，對(duì)其內(nèi)部包裹的探針具有很好的抗環(huán)境干擾保護(hù)作用。該方法不僅會(huì)促進(jìn)銅離子的大眾化檢測(cè)應(yīng)用，而

7、且這種基于“水凝膠試紙”的傳感理念也將適用于其他目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。
　　三、基于poly(T)穩(wěn)定的熒光銅納米顆粒對(duì)核酸酶免標(biāo)記高靈敏檢測(cè)及其抑制劑篩選研究由于poly(T)穩(wěn)定的熒光CuNPs的信號(hào)對(duì)poly(T)長(zhǎng)度的高度依賴性，我們以poly(T)為檢測(cè)探針，其穩(wěn)定合成的熒光CuNPs作為信號(hào)單元，發(fā)展了一種超靈敏的核酸酶檢測(cè)方法。Poly(T)被核酸酶處理之后，降解成單個(gè)的核苷酸或者短的寡核苷酸片段，不具備穩(wěn)定合成熒光CuN

8、Ps的能力，熒光信號(hào)消失。該方法在操作上簡(jiǎn)單快捷，不需要對(duì)檢測(cè)探針做任何修飾或標(biāo)記;原位合成的熒光銅納米顆粒信號(hào)產(chǎn)生快，檢測(cè)時(shí)間短。以S1核酸酶為模式靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了極低的檢測(cè)下限和良好的線性范圍，最低可檢測(cè)濃度為5×10-7 unitsμL-1，相對(duì)于其他酶類和蛋白質(zhì)，具有很好的選擇性。同時(shí)，該方法具備對(duì)核酸酶抑制劑篩選的能力。
　　四、基于dsDNA穩(wěn)定的熒光銅納米顆粒和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)核酸的放大檢測(cè)研究在本工作中，我們將雙鏈DN

9、A(dsDNA)穩(wěn)定合成的熒光CuNPs發(fā)展成一種“綠色”納米染料，用于PCR放大產(chǎn)物的信號(hào)獲取、以及靶標(biāo)核酸分子的放大檢測(cè)。當(dāng)有靶標(biāo)DNA分子存在的時(shí)候，經(jīng)過PCR放大后產(chǎn)生大量的dsDNA，可穩(wěn)定熒光CuNPs的合成，在紫外光激發(fā)下，可以檢測(cè)到熒光信號(hào)。該核酸放大檢測(cè)方法具有信號(hào)響應(yīng)快、成本低廉的特點(diǎn);相對(duì)于傳統(tǒng)有機(jī)嵌入染料而言，熒光CuNPs具有低毒環(huán)保的優(yōu)勢(shì);相對(duì)于染料標(biāo)記的核酸探針而言，熒光CuNPs具有操作簡(jiǎn)單、免標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)

10、。
　　五、基于靶標(biāo)催化的核酸動(dòng)態(tài)自組裝和芘二聚體熒光開關(guān)效應(yīng)對(duì)核酸的免酶恒溫放大檢測(cè)研究在核酸分子的放大檢測(cè)中，除了PCR等酶促循環(huán)放大技術(shù)之外，發(fā)展恒溫、甚至免酶的核酸放大技術(shù)是目前分析化學(xué)研究中的一大熱點(diǎn)。我們?cè)O(shè)計(jì)了三個(gè)亞穩(wěn)態(tài)的發(fā)夾探針作為自組裝原料，每個(gè)探針的5'端具有12個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的粘性末端，每個(gè)探針的5'和3'端都標(biāo)記有空間敏感性染料分子芘(pyrene)。當(dāng)引入靶標(biāo)核酸分子的時(shí)候，靶標(biāo)分子會(huì)催化探針之間發(fā)生鏈置換反

11、應(yīng)，組裝成Y字型結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的末端為平齊末端，使得相鄰探針上的芘分子靠近產(chǎn)生excimer熒光信號(hào)。每一輪組裝產(chǎn)生1個(gè)字型核酸結(jié)構(gòu)、3個(gè)excimer，并且可以將靶標(biāo)分子置換下來用于下一輪催化組裝，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的循環(huán)放大。該方法具有較好的特異性和靈敏度，對(duì)模式DNA分子的檢測(cè)下限可以達(dá)到10pM。相對(duì)于PCR等酶促循環(huán)放大技術(shù)，該放大方法不需要酶蛋白的參與、不依賴于高精度的熱循環(huán)裝置、操作簡(jiǎn)單。
　　六、基于雙響應(yīng)單分子熒光核酸探

12、針的設(shè)計(jì)對(duì)汞離子和銀離子的多靶標(biāo)檢測(cè)研究除了放大技術(shù)的發(fā)展，多功能核酸探針的設(shè)計(jì)也是核酸探針研究與應(yīng)用中的一大熱點(diǎn)。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種能夠?qū)x子和銀離子具有雙響應(yīng)的單分子多功能核酸探針(unimolecular multifunctional DNA probe，UMDP)，并將其用于汞離子和銀離子的多靶標(biāo)檢測(cè)。當(dāng)檢測(cè)體系中有靶標(biāo)離子的時(shí)候，UMDP被誘導(dǎo)從單鏈轉(zhuǎn)換成發(fā)夾構(gòu)型。兩端標(biāo)記的熒光基團(tuán)FAM和淬滅基團(tuán)DABCYL靠近，熒光熄滅。

13、該探針對(duì)靶標(biāo)離子的檢測(cè)具有很好的選擇性，對(duì)Hg2+和Ag+的檢測(cè)下限分別為0.67nM和0.95nM。同時(shí)，通過富C鏈(C-rich DNA)對(duì)熄滅后的熒光信號(hào)的恢復(fù)情況，我們可以實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種靶標(biāo)離子的區(qū)分。
　　七、基于雙響應(yīng)單分子核酸探針和免修飾的金納米顆粒對(duì)汞離子和銀離子的多靶標(biāo)比色法檢測(cè)研究為了使信號(hào)獲取更加方便快捷，我們基于UMDP和免修飾的金納米顆粒、針對(duì)汞離子和銀離子構(gòu)建了一種多靶標(biāo)比色檢測(cè)方法。在沒有靶標(biāo)離子存在的時(shí)

14、候，探針為自由單鏈狀態(tài)，能夠很好的吸附在金納米顆粒表面，提高其膠體穩(wěn)定性，使得金納米顆粒在較高的鹽濃度下能夠分散存在，顏色為酒紅色;當(dāng)存在靶標(biāo)離子的時(shí)候，靶標(biāo)離子誘導(dǎo)探針形成發(fā)夾構(gòu)型，由于雙鏈和發(fā)夾DNA對(duì)金納米顆粒的穩(wěn)定作用較差，使得金納米顆粒在較高的鹽濃度下發(fā)生團(tuán)聚，顏色變?yōu)樗{(lán)色，同時(shí)伴隨著吸收光譜的紅移。該多靶標(biāo)檢測(cè)方法，對(duì)靶標(biāo)離子有很好的選擇性，對(duì)Hg2+和Ag+的檢測(cè)下限分別為250nM和500nM。同時(shí)，我們利用EDTA對(duì)兩