銀、金納米團簇的合成及其在生化分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、貴金屬納米團簇(Noble metal naonoclusters)是由幾個到數(shù)百個金屬原子堆積而成，尺寸與費米波長相當(dāng)，呈現(xiàn)有類似半導(dǎo)體的特征，可以產(chǎn)生特定的能級分離并在一定波長光激發(fā)下發(fā)射熒光。相比有機熒光染料、半導(dǎo)體量子點、聚合物納米顆粒等熒光納米探針而言，貴金屬納米簇由于其獨特的電子結(jié)構(gòu)和隨之產(chǎn)生的不同尋常的物理、化學(xué)性質(zhì)，在納米材料研究中備受關(guān)注，可以作為頗有前景的熒光探針廣泛應(yīng)用于生化傳感、生物標(biāo)記、光學(xué)成像及單分子成像研究

2、等領(lǐng)域。但是目前對于貴金屬納米團簇的研究還存在著一定的缺陷和不足，比如熒光量子產(chǎn)率(QY)高、生物相容性好并且簡單易重復(fù)的貴金屬納米團簇難以合成，基于貴金屬納米簇的高靈敏分析方法有待提高，以及貴金屬納米簇的化學(xué)活性很高、在溶液中性能不夠穩(wěn)定等問題。因此，本文以貴金屬納米簇為研究對象，針對銀納米團簇(AgNCs)和金納米團簇(AuNCs)在合成及熒光分析和成像中存在的問題，進行了以下兩個部分的研究:
　　1.AgNCs的設(shè)計合成及其

3、在生化分子檢測中的應(yīng)用首先，我們合理設(shè)計了寡聚核苷酸序列并將其作為模板合成了高發(fā)光性能的AgNCs。當(dāng)用寡聚核苷酸作為模板分子來合成AgNCs時，其序列結(jié)構(gòu)對產(chǎn)物的性能影響很大。在所有核苷酸的堿基中胞嘧啶（C堿基）具有與Ag+最強的結(jié)合能力，寡聚鳥苷酸（G堿基）大量存在易發(fā)生自折疊，在序列中同時存在腺嘌呤（A堿基）、胸腺嘧啶（T堿基）時易發(fā)生雜交從而導(dǎo)致自身團聚，并且模板中如果胞嘧啶比例過高易使合成的銀納米簇發(fā)生自吸，降低其發(fā)光效率。綜

4、合考慮以上這些因素，我們采用了胞嘧啶和腺嘌呤各占50％的寡聚核苷酸序列作為模板分子，成功地制備出穩(wěn)定性好、熒光性能優(yōu)異的DNA-AgNCs，與對照組的寡聚核苷酸穩(wěn)定的銀納米簇相比較，驗證了我們設(shè)計思路的合理性。同時，實驗發(fā)現(xiàn)含巰基藥物可以高選擇性地與銀簇通過Ag-S共價鍵發(fā)生相互作用，使得DNA-AgNCs的熒光被靜態(tài)猝滅?；谶@一原理，我們建立了一種以抗高血壓藥物卡托普利為代表的含巰基物質(zhì)的熒光分析新方法。該方法快速、準(zhǔn)確、選擇性好、

5、靈敏度高、抗干擾能力強，可成功應(yīng)用于實際樣品卡托普利片的分析。
　　其次，在文獻合成寡聚核苷酸穩(wěn)定的銀納米簇的基礎(chǔ)上，我們提出了一種具有高信噪比的熒光“開-關(guān)-開”式策略，用于高選擇性、高靈敏地定量檢測細(xì)菌嚴(yán)緊激素(ppGpp)。ppGpp是細(xì)菌在面臨各種極端條件下產(chǎn)生的一種重要生理信號分子，定量分析ppGpp對我們監(jiān)測細(xì)菌的生理活動具有十分重要的意義。在此，我們利用Cu2+作為熒光猝滅劑，當(dāng)其與DNA-AgNCs接觸時會導(dǎo)致DN

6、A-AgNCs的熒光發(fā)生猝滅，而Cu2+又可以通過配位作用對ppGpp進行特異性的識別，所以當(dāng)ppGpp被引入到Cu2+-AgNCs復(fù)合物中時，使得DNA-AgNCs的熒光信號得以恢復(fù)。DNA-AgNCs的熒光“開-關(guān)-開”現(xiàn)象，降低了方法的背景信號，提高了檢測方法的信噪比，也實現(xiàn)了高特異性識別?；诖?，我們不僅可以實現(xiàn)2-200μmol/L寬線性范圍內(nèi)ppGpp的高選擇性測定，而且還加深了我們對DNA-AgNCs，Cu2+和ppGpp

7、之間相互作用的理解。與已報道的檢測ppGpp的方法相比較，本方法簡單、快速、選擇性好、靈敏度高、具有相對較寬的檢測范圍，而且還避免了用于識別ppGpp的有機配體的復(fù)雜合成。該研究為我們選擇高識別度、高信噪比的貴金屬納米團簇作為熒光探針用于生化分析檢測開拓了新思路。
　　2.高熒光量子產(chǎn)率的AuNCs的合成及其在光學(xué)成像中的應(yīng)用首先，我們發(fā)展了快速、簡單、高效的綠色方法制備出性質(zhì)穩(wěn)定且具有優(yōu)異發(fā)光性能的BSA-Au20NCs。通過篩

8、選合適的配體、設(shè)計合理的合成路線以及調(diào)控反應(yīng)動力學(xué)，我們成功地解決了在水溶液中快速合成高熒光量子產(chǎn)率、高穩(wěn)定性的AuNCs這一技術(shù)難題。在這種新型發(fā)光BSA-Au20NCs納米探針的制備過程中，有效地避免了使用有機溶劑或有毒的反應(yīng)試劑，也不需要復(fù)雜的樣品制備和純化過程，并且整個實驗過程在1小時內(nèi)便可完成。通過調(diào)控反應(yīng)體系的酸堿性和適宜的溫度等來加速還原動力學(xué)，最終制備出小尺寸的BSA-Au20NCs，其熒光量子產(chǎn)率高達15％，生物相容性

9、好，可以在較寬的pH范圍內(nèi)維持熒光性質(zhì)穩(wěn)定，長時間光激發(fā)下不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象，而且在各種不同的生物介質(zhì)中均具有高度穩(wěn)定性。因此，我們合成的BSA-Au20NCs有望作為優(yōu)異的熒光探針進一步應(yīng)用于生化傳感、生物標(biāo)記和生物成像等領(lǐng)域。
　　除了發(fā)展液相合成，我們還在固相界面上原位合成了AuNCs，即利用天然蠶絲作為模板分子，通過其表面蛋白質(zhì)與金前驅(qū)體的氧化還原反應(yīng)制備出摻雜了AuNCs的發(fā)光蠶絲。AuNCs由于其亞納米尺寸而具有較高的

10、表面能，使得在液相中的Au原子具有較高的化學(xué)活性，容易發(fā)生重排或團聚，從而限制了其諸多應(yīng)用。因此，我們通過在固相界面上原位合成蛋白穩(wěn)定的AuNCs，較好地解決了這一難題，并很好地保持了AuNCs優(yōu)異的光學(xué)性能。我們的研究將原位固定AuNCs與蠶絲改性同時結(jié)合起來，闡釋了一種可以通過納米技術(shù)，原位化學(xué)制備摻雜AuNCs的發(fā)光蠶絲的簡單方法。該方法制備得到的發(fā)光蠶絲在紫外光照射下呈現(xiàn)出強烈、穩(wěn)定的紅色熒光（絕對量子產(chǎn)率為8％），具有較長的熒

11、光壽命和優(yōu)良的生物安全性。此外，這種摻雜了AuNCs的發(fā)光蠶絲相比天然蠶絲而言，具有更好的機械性能（約提升1.3倍）和抗紫外線能力（約提升1.5倍）。作為一種通用的方法，我們采用類似的技術(shù)可以直接得到在天然蠶絲織物上摻雜了AuNCs的發(fā)光蠶絲織物。得益于這些優(yōu)勢，我們進一步將這種發(fā)光蠶絲和發(fā)光蠶絲織物成功地應(yīng)用于防偽標(biāo)記的設(shè)計和應(yīng)用。
　　最后，我們利用葉酸和透明質(zhì)酸作為主動靶向識別基團，分別對BSA-Au20NCs進行表面功能化

12、，并將功能化的BSA-Au20NCs成功應(yīng)用于體內(nèi)外主動靶向成像的研究中。目前，基于AuNCs探針的熒光成像研究大多依賴于納米材料自身性質(zhì)帶來的被動靶向作用機制，即利用其亞納米的尺寸效應(yīng)，通過細(xì)胞內(nèi)吞和納米探針的高通量高滯留效應(yīng)使得AuNCs探針富積到腫瘤部位，因此成像效果不夠理想。在此基礎(chǔ)上，我們首先將可以與癌細(xì)胞表面受體分子進行特異性識別的配體修飾到性能優(yōu)越的BSA-Au20NCs表面，通過特異性受體介導(dǎo)的主動靶向作用方式將功能化的

13、BSA-Au20NCs探針富積到腫瘤區(qū)域，并利用BSA-Au20NCs探針的熒光信號對癌細(xì)胞和腫瘤進行鑒別、成像，以實現(xiàn)對癌癥的早期檢測。相比于被動靶向機制的熒光成像模式，受體介導(dǎo)的主動靶向成像模式可以實現(xiàn)對腫瘤部位更高效、全面地標(biāo)記和成像效果。因此，本文所制備的功能化BSA-Au20NCs熒光探針及受體介導(dǎo)的主動靶向熒光成像模式將有望在癌癥的早期診斷及臨床治療中發(fā)揮重要作用。
　　總之，本文合成了生物大分子穩(wěn)定的銀和金納米簇，基

14、于其優(yōu)異的性能，以熒光光譜法和熒光成像為主要研究手段，進一步將制備的發(fā)光貴金屬納米簇應(yīng)用于生化分析中。一方面，我們通過合理地設(shè)計寡核苷酸序列合成了熒光性質(zhì)優(yōu)異的AgNCs，探討了不同寡聚核苷酸穩(wěn)定AgNCs的熒光性質(zhì)及其對分析物的響應(yīng)模式，并成功地將其用于含巰基藥物和細(xì)菌生理過程中重要信號分子的高選擇性、高靈敏度分析檢測;另一方面，通過調(diào)控反應(yīng)動力學(xué)，我們分別成功地在液相和固相基質(zhì)中合成了蛋白質(zhì)穩(wěn)定的AuNCs?；贏uNCs優(yōu)異的發(fā)光