短鏈脂肪酸促進人和小鼠gastroids中產(chǎn)ghrelin細胞分化和小鼠胃排空的生理機制研究.pdf

1、Ghrelin是由胃粘膜中的內(nèi)分泌細胞分泌而來，結(jié)構(gòu)上與胃動素相似，是生長激素促分泌素受體的第一個內(nèi)源性配體，由28個氨基酸組成，分子量3310，ghrelin有兩種存在方式，即N端3位絲氨酸殘基辛?；头酋；膅hrelin。它除了促進生長激素的釋放、促進糖代謝、促進食欲、促進細胞增殖和抑制炎癥因子釋放外，還具有促進胃動力和加速胃排空的作用。但是，生理情況下血清中g(shù)hrelin只在長時間禁食后才會增加，并于進食后減少。因此它很難調(diào)節(jié)餐

2、后的胃排空。
　　膳食纖維是包括可溶性纖維和不可溶性纖維的一種復(fù)雜的碳水化合物。不可溶性纖維有很多重要的特點，但可溶性纖維素可以在結(jié)腸經(jīng)菌群酵解后產(chǎn)生大量的具有生理活性的產(chǎn)物，其中最主要的是短鏈脂肪酸，包括乙酸、丙酸和丁酸。它們在消化道有著非常重要的作用，包括給腸道上皮細胞提供能量和改變消化道的功能和結(jié)構(gòu)。這些作用主要通過作用于GPR41和GPR43介導(dǎo)。Petersen等通過三維體外培養(yǎng)人和小鼠小腸organoid（器官球）的平

3、臺，發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸可以選擇性促進入和小鼠小腸organoid中L細胞的大量分化，從而促進大量GLP-1的分泌。
　　消化道上皮包含一個持續(xù)快速更新的系統(tǒng)，由腸道干細胞觸發(fā)。這個系統(tǒng)可以很好的用來研究細胞的分化、增殖和遷移。最近，Sato和他的同事通過體外培養(yǎng)胃、小腸和結(jié)腸的上皮或者單獨分離的干細胞進行體外培養(yǎng)，長成隱窩或腺體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以持續(xù)產(chǎn)生組織來源的各種分化細胞。這些三維上皮結(jié)構(gòu)起初命名為“organoid”，為了避免組

4、織來源的混淆和由之前由隱窩和腺體周圍的肌成纖維細胞組成的organoid的區(qū)別，我們把來源于胃的命名為gastroid，來源于小腸的命名為enteroid，來源于結(jié)腸的命名為colonoid。這種體外培養(yǎng)系統(tǒng)可以用來繼續(xù)研究胃腸道干細胞的調(diào)節(jié)和消化道上皮細胞的增殖和分化。
　　由于胃排空延遲的疾病很常見，包括糖尿病性或者特發(fā)性胃輕癱、功能性消化不良、手術(shù)后和腸內(nèi)營養(yǎng)的患者。主要癥狀有胃飽脹感、腹痛、腹脹、早飽、惡心甚至嘔吐。目前g

5、hrelin已經(jīng)被證明可以增加胃的三相收縮促進胃排空。因此，本研究利用gastroids三維體外培養(yǎng)系統(tǒng)，研究短鏈脂肪酸對產(chǎn)ghrelin內(nèi)分泌細胞的影響和作用機制。與此同時，我們通過在體實驗，研究高纖維素飲食和短鏈脂肪酸對胃和血液中g(shù)hrelin表達的影響，以及胃排空的影響。
　　本研究的主要研究結(jié)果如下:
　　一、離體實驗
　　1、為了明確短鏈脂肪酸對產(chǎn)ghrelin內(nèi)分泌細胞的分化的影響，我們通過該三維體外培養(yǎng)的

6、gastroid系統(tǒng)研究短鏈脂肪酸對產(chǎn)ghrelin細胞分化的影響。我們通過3D體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)小鼠和人的胃腺，獲得具有胃干細胞特性的Gastroid，培養(yǎng)三周后，與乙酸(5mM)、丙酸(1mM)和丁酸(1mM)的混合物共培養(yǎng)24小時，對照組加正常培養(yǎng)基或者長鏈脂肪酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸混合物組與正常對照和長鏈脂肪酸處理組相比，ghrelin的基因表達增加了6-8倍。
　　2、短鏈脂肪酸分別在機體中存在兩種受體GPR41和GPR4

7、3，為了進一步明確哪種受體起主要作用，我們利用GPR41和GPR43激動劑分別和gastroid共培養(yǎng)24小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GPR43激動劑處理組與正常組相比，ghrelin基因表達增加了6-12倍左右。同時免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn)GPR43激動劑處理組GPC的表達量與其他兩組相比大量增加，同時90％的GPC表達GPR43。因此短鏈脂肪酸促進產(chǎn)ghrelin細胞分化的作用是通過GPR43介導(dǎo)的。
　　3、為了明確哪種短鏈脂肪酸起主要作用，我

8、們分別利用三種短鏈脂肪酸各自和gastroid共培養(yǎng)，RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁酸處理組小鼠gastroids的ghrelin基因表達增加了8.46倍，人gastroids的ghrelin基因表達增加了4.68倍。免疫熒光結(jié)果表明丁酸組GPC表達大量增加。因此丁酸是特異性促進產(chǎn)ghrelin內(nèi)分泌細胞分化的短鏈脂肪酸。
　　4、為了進一步驗證短鏈脂肪酸丁酸促進產(chǎn)Ghrelin細胞分化的獨特作用，我們運用PCR技術(shù)檢查了神經(jīng)內(nèi)分泌細胞標

9、記物CGA，胃祖細胞標記物SOX9，胃表面粘液細胞標記物MUC5AC，胃腺細胞標記物TFF2，胃主細胞標記物MIST1和胃壁細胞標記物ATP4A的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁酸只促進與產(chǎn)ghrelin內(nèi)分泌細胞分化相關(guān)的CGA和SOX9表達增加，其他細胞標記物無明顯改變。因此我們認為短鏈脂肪酸中丁酸可以特異性的通過GPR43受體促進人和小鼠gastroid中產(chǎn)ghrelin內(nèi)分泌細胞的分化。
　　二、在體實驗
　　1、通過體外實驗我

10、們明確了短鏈脂肪酸丁酸可以特異性的作用GPR43受體并促進產(chǎn)ghrelin細胞的分化。為了進一步明確這種作用，我們進行了體內(nèi)實驗。我們首先采用2周的高纖維飲食（果膠，30％）模型和高丁酸(丁酸，100mM)飲水模型檢查短鏈脂肪酸對ghrelin表達的影響，western和PCR結(jié)果都表明二者都可以促進正常生理狀態(tài)下胃中g(shù)hrelin的表達，ELISA方法也表明它們都可以增加生理狀態(tài)下血清中活性ghrelin的含量。
　　2、與此同

11、時，我們進行胃排空實驗，將小鼠分為三組，正常組、高纖維飲食組和高丁酸飲水組。兩周后，小鼠進食20小時后進行胃排空實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高纖維素飲食組和高丁酸飲水組1小時胃排空量相較與正常組顯著增加。因此我們認為高纖維飲食和高丁酸飲水都可以促進胃排空。
　　3、為了明確此作用是否是通過ghrelin表達所介導(dǎo)，我們用ghrelin拮抗劑處理高纖維飲食和高丁酸飲水組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的促胃排空作用可以被ghrelin拮抗劑阻斷，因此我們認為高纖維