ISP雞肝蛋白的乳化特性形成機(jī)制研究.pdf

1、雞肝蛋白中氨基酸構(gòu)成均衡，是一種優(yōu)質(zhì)完全蛋白，在雞肝中含量近20％。我國(guó)雞肝每年產(chǎn)量高達(dá)50余萬(wàn)噸，多以鮮銷或者作為動(dòng)物、水產(chǎn)飼料資源加以利用，提高其附加值的深加工利用很少，沒(méi)有充分體現(xiàn)其應(yīng)有的價(jià)值。究其原因是由于人們對(duì)雞肝的加工特性了解不多，尤其是對(duì)其中高含量的、種類繁多復(fù)雜的雞肝蛋白研究甚少。如何把低值雞肝中的優(yōu)質(zhì)蛋白提取，弄清其主要加工特性和機(jī)制，并應(yīng)用到食品工業(yè)中，便顯得很有意義和價(jià)值。
　　ISP（等電點(diǎn)溶解/沉淀法，I

2、soelectric Solubilization/Precipitation）技術(shù)因具有高提取率、安全和無(wú)污染等顯著優(yōu)點(diǎn)，在提取水產(chǎn)品、雞肉和機(jī)械去骨火雞肉等原料中的蛋白的應(yīng)用已非常多，且對(duì)水產(chǎn)品的蛋白提取已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但I(xiàn)SP技術(shù)對(duì)雞肝蛋白的提取和其乳化特性有何影響？其乳化特性形成機(jī)制是怎樣的需要弄清和明確。非標(biāo)記液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)定量(Label-free LC MS/MS)技術(shù)在復(fù)雜蛋白質(zhì)研究中具有明顯優(yōu)勢(shì)。本論文

3、探究了用ISP技術(shù)提取的雞肝蛋白的提取率和理化特性，并重點(diǎn)研究ISP技術(shù)提取的雞肝蛋白的乳化特性及其形成機(jī)理。結(jié)合蛋白組學(xué)的研究，進(jìn)一步輔助闡明了ISP雞肝蛋白的乳化形成機(jī)制，為ISP技術(shù)提取的雞肝蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.正常和異色新鮮雞肝理化與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的比較研究
　　評(píng)價(jià)了正常和異常顏色雞肝理化和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的差異以及其安全性，為兩種雞肝的食用和進(jìn)一步加工利用提供科

4、學(xué)依據(jù)。試驗(yàn)采取不同批次同品種的雞肝，分別測(cè)量其主要化學(xué)成份、pH、總色素含量、脂肪酸、氨基酸構(gòu)成、礦物質(zhì)元素及重金屬含量。結(jié)果表明:正常顏色的雞肝蛋白質(zhì)和水分含量極顯著高于異常顏色的雞肝（P＜0.01），而脂肪和灰分含量極顯著低于異常顏色的雞肝(P＜0.01)，pH值和總色素含量正常顏色雞肝也均顯著高于（P＜0.05）異常顏色雞肝;相比異常顏色雞肝，正常顏色雞肝含有大量多不飽和脂肪酸(PUFA)(P＜0.05)，較高的飽和脂肪酸(SF

5、A)，但PUFA/SFA值（為0.453）也顯著（P＜0.05）較高;正常顏色雞肝與異常顏色雞肝相比，有7種氨基酸構(gòu)成差異顯著（P＜0.05），其中丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、賴氨酸和組氨酸這5種氨基酸百分含量顯著高于異常顏色雞肝（P＜0.05）;正常顏色的雞肝鉀、鈉、磷、銅、鐵和硒的含量顯著(P＜0.05)高于異常顏色的雞肝，而異常顏色雞肝中鈣含量顯著高于正常顏色組(P＜0.05)。兩種雞肝中都檢測(cè)出高含量的鐵和鋅，以及一定含量的硒;雖然

6、在兩種顏色的雞肝中都檢測(cè)到了鉛和鎘，但含量極低，符合食品安全限量規(guī)定。盡管正常顏色雞肝比異常顏色雞肝具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但都是安全可食用的副產(chǎn)物。
　　2.雞肝乳化過(guò)程中蛋白構(gòu)象變化與保油保水性的關(guān)系研究
　　通過(guò)拉曼光譜和低場(chǎng)核磁共振技術(shù)，探討了雞肝醬糜在不同介質(zhì)（葵花籽和芥花混合油替代0％～40％豬背膘，結(jié)合預(yù)乳化和新鮮雞肝斬拌乳化）乳化過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和水分分布的變化。結(jié)果表明:預(yù)乳化豬背膘和用超過(guò)20％植物油替代豬背

7、膘，增加了水油結(jié)合能力，形成更均勻細(xì)膩的微觀結(jié)構(gòu)，并且NMR弛豫時(shí)間(T21a、T21b和T22)逐漸降低，這主要是由于雞肝醬糜中低的汁液損失。拉曼光譜結(jié)果表明，當(dāng)預(yù)乳化的植物油替代比例達(dá)到20％～40％時(shí)，和對(duì)照組相比，雞肝醬糜的α-螺旋含量下降，并伴隨著β-折疊結(jié)構(gòu)含量上升。雞肝醬糜中色氨酸和酪氨酸的雙峰疏水殘基比例也受預(yù)乳化和植物油替代的影響，從而揭示了雞肝蛋白和預(yù)乳化植物油形成穩(wěn)定乳化液的形成機(jī)制。
　　3.ISP雞肝蛋白

8、提取率及其組分構(gòu)成研究
　　研究雞肝經(jīng)過(guò)酸（pH2.0、2.5、3.0和3.5）和堿（pH10.5、11.0、11.5和12.0）溶解、pH5.5沉淀時(shí)雞肝蛋白的提取效率和回收蛋白的組分。研究結(jié)果表明:蛋白提取率最高在pH2.0、11.5和pH12.0，回收率分別達(dá)到77.90％、78.38％和79.29％。pH3.5時(shí)的提取率最低(58.53％)。pH3.0和pH3.5有利于提取鹽溶蛋白，而pH10.5、11.0和11.5提取更

9、多的是水溶性蛋白，ISP方法能提取更多的不溶性蛋白。酸提取的總色素含量顯著高于堿處理樣品(P＜0.05)，pH2.5時(shí)的總色素含量最高。除pH2.0組外，堿溶解提取的雞肝蛋白粒徑D10、D50、D90、D3,2和D4,3值均顯著高于酸提取組(P＜0.05)，且隨pH值增大而顯著增加(P＜0.05)。ISP除對(duì)賴氨酸和半胱氨酸構(gòu)成有影響外，對(duì)其它氨基酸構(gòu)成無(wú)影響(P＞0.05)，必需氨基酸與總的氨基酸比值也差異不顯著（P＞0.05）。SD

10、S-PAGE條帶表明和酸處理相比，堿處理得到的肌球蛋白重鏈(MHC)和肌動(dòng)蛋白含量高。因此，利用ISP處理回收高值蛋白資源的方法將為開(kāi)發(fā)具有功能特性的新產(chǎn)品提供便利，并且可以拓展雞肝臟的利用價(jià)值。
　　4.ISP雞肝蛋白乳化特性及其構(gòu)象變化的研究
　　通過(guò)測(cè)定酸（pH2.0、2.5、3.0和3.5）、堿（pH10.5、11.0、11.5和12.0）加工提取的雞肝蛋白以及原料雞肝分別與植物油乳化后的乳化穩(wěn)定性、活性、黏度和光學(xué)

11、顯微結(jié)構(gòu)等，比較研究了它們?nèi)榛匦缘牟町?。并?yīng)用拉曼光譜技術(shù)研究了ISP提取的雞肝蛋白在乳化過(guò)程中的構(gòu)象變化對(duì)乳化特性的影響機(jī)制。研究結(jié)果表明:相比酸溶解提取的雞肝蛋白組，堿溶解雞肝蛋白組具有顯著高的乳化穩(wěn)定性、乳化活性和黏度(P＜0.05)，其中pH11.0溶解提取的雞肝蛋白組的乳化特性甚至好于原料雞肝蛋白，具有最大的乳化穩(wěn)定性、乳化活性和黏度（P＜0.05），其次是pH11.5。pH2.5和3.0組具有最小的乳化穩(wěn)定性、乳化活性和黏

12、度（P＜0.05）。除pH2.0組外，堿提取組（pH11.0、11.5和12.0）的乳化液粒徑D3,2、D4,3、D10、D50和D90值都大于酸提取組，這是由于堿溶解能提取較大粒徑蛋白引起的緣故。ISP雞肝蛋白以及原料雞肝的乳化液的光學(xué)顯微圖顯示，酸溶解提取的雞肝蛋白乳化液具有相對(duì)較大的不規(guī)則液滴，且呈不規(guī)則分布，液滴與液滴之間表現(xiàn)出凝集的相連現(xiàn)象，尤其是pH3.0表現(xiàn)的很明顯。堿溶解提取的雞肝蛋白，則表現(xiàn)出了明顯相對(duì)較小的球狀液滴，

13、且在連續(xù)相中均勻分布，pH11.0組表現(xiàn)的尤為明顯，這種液滴均勻一致地分布有利于形成穩(wěn)定的乳化液。乳化層的拉曼光譜顯示，相比原料雞肝，ISP蛋白乳化后均涉及二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，其中堿溶解組α-螺旋含量顯著減少(P＜0.05)，β-折疊增加。酸溶解組α-螺旋含量也顯著減小(P＜0.05)，但β-折疊也減少了，無(wú)規(guī)則或隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)含量顯著增加(P＜0.05)。β-折疊的增加則有利于形成穩(wěn)定乳化液，與保油保水性的提高有很大關(guān)系。ISP增加了扭式-

14、扭式-反式的二硫鍵構(gòu)象，堿溶解組g構(gòu)象也顯著增加(P＜0.05)。ISP后，乳化時(shí)會(huì)使色氨酸殘基從極性的暴露狀態(tài)向包埋狀態(tài)轉(zhuǎn)變，酪氨酸殘基是暴露的或是能夠參與中度或弱的氫鍵形成。堿溶解的蛋白質(zhì)側(cè)鏈在乳化反應(yīng)過(guò)程中表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，甲基和亞甲基被包埋，暴露了疏水性氨基酸，造成了疏水相互作用增強(qiáng)，從而增加了乳化穩(wěn)定性。
　　5.ISP雞肝蛋白乳化過(guò)程中的非標(biāo)記液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究
　　采用ISP提取的雞肝蛋白與植

15、物油乳化后，提取乳化層中的蛋白，利用非標(biāo)記液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Label-free LC MS/MS）蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)研究參加乳化的蛋白種類和數(shù)量，并對(duì)蛋白進(jìn)行功能注釋。研究結(jié)果表明，9組樣品乳化層中的蛋白歸并后共鑒定到2662種蛋白質(zhì)，pH2.0、2.5、3.0、3.5、10.5、11.0、11.5、12.0和原料雞肝中分別鑒定出:1729、1724、1783、1728、1923、2218、2110、2092和1477種蛋白，pH1

16、1.0乳化層中參加乳化蛋白質(zhì)種類最多、其次是pH11.5和12.0，原料雞肝組最少。各組中高豐度蛋白的種類和數(shù)量各不相同，每組前20個(gè)高豐度蛋白中獨(dú)有的蛋白個(gè)數(shù)分別為3個(gè)（pH2.0組）、3個(gè)（pH2.5組）、6個(gè)（pH3.0組）、2個(gè)(pH3.5組)、3個(gè)（pH10.5組）、1個(gè)（pH11.0組）、1個(gè)（pH11.5組）、3個(gè)(pH12.0組)和0個(gè)（原料組）。與原料雞肝組相比，其它各組前20個(gè)高豐度蛋白的含量差異倍數(shù)完全不同。相比酸