NONO對(duì)LPS誘導(dǎo)的SOD2基因表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、內(nèi)毒素血癥是由G-菌釋放的內(nèi)毒素(又名脂多糖,lipopolysaccharide,LPS)引起的全身炎癥反應(yīng)綜合癥,是多系統(tǒng)多種疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥,通常導(dǎo)致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血等,病死率極高。在內(nèi)毒素血癥過程中,脂多糖可以促使吞噬細(xì)胞發(fā)生呼吸爆發(fā),釋放大量超氧陰離子等活性氧(reactive oxygen species,ROS)。研究已經(jīng)表明,ROS在機(jī)體的病理生理過程中起著雙重作用,一方面,適量的ROS

2、對(duì)機(jī)體有重要的保護(hù)作用；另一方面,在持續(xù)大量的ROS作用下,生物大分子脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等會(huì)發(fā)生氧化損傷,進(jìn)而與TNF-α、IL等致炎因子共同導(dǎo)致廣泛性的組織損傷和器官衰竭,使內(nèi)毒素血癥趨于惡化。
　　 SOD是一種普遍存在于生物體中的含金屬離子的超氧化物歧化酶,可以催化超氧化物發(fā)生歧化反應(yīng),清除氧自由基,進(jìn)而在抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制腫瘤、自身免疫疾病方面發(fā)揮重要作用。SOD2是真核生物SOD的一種亞型,是位于線粒體的錳超氧化

3、物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD,SOD2),線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生和氧代謝的重要場(chǎng)所,也是自由基產(chǎn)生的場(chǎng)所,由此決定了SOD2在抗氧化損傷中的特殊地位。
　　 不同亞型的SOD在生物體中的表達(dá)方式不同,其中SOD2在多種組織細(xì)胞中均有表達(dá),但更主要的是受細(xì)胞內(nèi)外各種因素的刺激發(fā)生誘導(dǎo)型表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到輻射、氧化劑、細(xì)胞因子、LPS等刺激時(shí),SOD2表達(dá)顯著提高,進(jìn)而使機(jī)體免受氧

4、自由基的損傷。因此研究各種刺激因素尤其是LPS誘導(dǎo)的SOD2表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)深入理解SOD2在細(xì)胞保護(hù)中的作用具有重要意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中已經(jīng)利用DNApull-down技術(shù)、差異蛋白DIGE分離、質(zhì)譜分析等技術(shù),鑒定出了24個(gè)可能參與LPS誘導(dǎo)的SOD2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白,其中包括NONO。那么,本課題的研究任務(wù)是:①驗(yàn)證前期鑒定出的NONO蛋白是否參與了LPS刺激下SOD2的表達(dá)調(diào)控:②若該蛋白有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,再進(jìn)

5、一步證明其在SOD2啟動(dòng)子序列上的大致結(jié)合范圍及相關(guān)的信號(hào)通路。完成該研究任務(wù)后的臨床意義:理解內(nèi)毒素血癥過程中SOD2高表達(dá)的機(jī)制,對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的治療手段很有意義。
　　 研究已經(jīng)表明,SOD2啟動(dòng)子序列缺乏TATA盒、CAAT盒,但轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游序列富含GC堿基,該序列上有公認(rèn)的NF-κ「 B結(jié)合位點(diǎn),及已經(jīng)被證實(shí)的SP-1、AP-2結(jié)合位點(diǎn)。那么,SOD2啟動(dòng)子序列上是否有NONO蛋白的作用位點(diǎn)及其是否受NONO調(diào)控,有待于

6、驗(yàn)證。不包含POU結(jié)構(gòu)域的八聚核苷酸結(jié)合蛋白(Non-POU domain-containing octamer-binding protein,NONO)是廣泛存在于真核細(xì)胞中的重要蛋白之一,在基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用。NONO是多功能核蛋白家族的一個(gè)成員,在人類該蛋白稱為p54nrb。該家族的蛋白羧基末端有2個(gè)保守的RRM(RNA Recognition motif)結(jié)構(gòu)域,可以識(shí)別、結(jié)合RNA或ssDNA。該結(jié)構(gòu)域由90個(gè)氨基酸殘

7、基組成,空間上形成2個(gè)α-螺旋和4股β-折疊片。NONO除了上述的2個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域外,還有1個(gè)DBD(DNA bindingdomain)結(jié)構(gòu)域,由1個(gè)HTH(helix-turn-helix)結(jié)構(gòu)及其后緊跟的1個(gè)堿性氨基酸或酸性氨基酸共同組成。這些結(jié)構(gòu)特征為其參與多種核內(nèi)事件提供了基礎(chǔ)。
　　 最近越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道,NONO參與不同基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。例如,p54nrb/NONO與HMGA1(high mobility grou

8、p protein A1)、蛋白相關(guān)剪切因子(protein-associated splicing factor,PSF)等蛋白形成復(fù)合體,共同參與小鼠RBP4(retinol-binding protein)基因的表達(dá)調(diào)控；NONO可以通過其某一位點(diǎn)氨基酸殘基的磷酸化或者借助某些橋梁蛋白參與炎癥過程中HASMC(人類大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞)P4Hα1(Prolyl-4-Hydroxylaseα1)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 綜上,依據(jù)以下

9、幾點(diǎn),我們推斷,NONO也可能參與了LPS誘導(dǎo)的SOD2表達(dá)調(diào)控:①NONO蛋白結(jié)構(gòu)特征；②文獻(xiàn)報(bào)道,NONO作為轉(zhuǎn)錄因子參與多種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的事實(shí)；③NONO蛋白是本實(shí)驗(yàn)室前期利用多種專業(yè)技術(shù)從內(nèi)毒素血癥小鼠組織核蛋白中篩選并鑒定出的SOD2啟動(dòng)子結(jié)合蛋白。
　　 為了證實(shí)上述推斷及相關(guān)的啟動(dòng)子區(qū)域和信號(hào)通路,我們從以下幾方面予以驗(yàn)證:
　　 (一)RT-PCR檢測(cè)LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞SOD2 mRNA表達(dá)的影

10、響采用RT-PCR方法檢測(cè)LPS刺激對(duì)RAW264.7細(xì)胞SOD2mRNA表達(dá)的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml LPS刺激RAW264.7細(xì)胞12h后,SOD2mRNA表達(dá)水平均有所增高。以1μg/mlLPS刺激RAW264.7細(xì)胞0h,1h,2h,4h,6h,12h后,與對(duì)照組相比,SOD2mRNA表達(dá)水平在刺激12h后增加最為明顯。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討LPS刺激下NONO對(duì)S

11、OD2表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 (二)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)NONO蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位情況為了明確LPS刺激及氧化刺激對(duì)NONO蛋白定位的影響,分別對(duì)RAW264.7細(xì)胞中內(nèi)源性NONO蛋白及NIH3T3細(xì)胞中過表達(dá)的NONO蛋白,進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示,靜息狀態(tài)下,內(nèi)源性NONO蛋白主要分布在RAW264.7細(xì)胞核中,胞漿中也有少量分布,LPS刺激后在胞核中聚集更為明顯；外源性NONO蛋白在靜息狀態(tài)下分布于NIH3T

12、3細(xì)胞漿中,亞砷酸鈉刺激1h后移位入核。這些結(jié)果證實(shí)了NONO蛋白有核內(nèi)定位現(xiàn)象,為NONO參與核內(nèi)事件提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　　 (三)從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)LPS刺激下NONO對(duì)SOD2表達(dá)水平的影響
　　 1.RT-PCR和Realtime PCR檢測(cè)NONO在LPS刺激下對(duì)RAW264.7細(xì)胞中SOD2表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)分組:①轉(zhuǎn)染pcDNA3-C-HA組；②轉(zhuǎn)染pcDNA3-C-HA后,LPS刺激細(xì)胞12

13、h；③轉(zhuǎn)染pcDNA3-NONO-HA組；④轉(zhuǎn)染pcDNA3-NONO-HA后,LPS刺激細(xì)胞12h。收細(xì)胞,提取總RNA,進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染pcDNA3-C—HA對(duì)照組相比,LPS刺激和NONO過表達(dá)均可增加SOD2的表達(dá),而且NONO過表達(dá)還可以進(jìn)一步增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的SOD2表達(dá)水平。
　　 2.雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)NONO過表達(dá)對(duì)SOD2啟動(dòng)子活性的影響。實(shí)驗(yàn)分組:①共轉(zhuǎn)染pGL3-control、p

14、cDNA3-C-HA、pRL-TK；②共轉(zhuǎn)染pGL3-sod2p、pcDNA3-C—HA、pRL-TK；③共轉(zhuǎn)染pGL3-sod2p、pcDNA3-NONO-HA、pRL-TK。檢測(cè)293細(xì)胞及NIH3T3細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性。結(jié)果顯示,在兩種細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,NONO過表達(dá)后,細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性均明顯增高,說明NONO過表達(dá)可以上調(diào)SOD啟動(dòng)子活性。
　　 3.Western-Blot技術(shù)檢測(cè)LPS刺激下NONO對(duì)R

15、AW264.7細(xì)胞中SOD2蛋白表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)分組:①轉(zhuǎn)染pcDNA3-C—HA組；②轉(zhuǎn)染pcDNA3-C-HA后,LPS刺激細(xì)胞12h；③轉(zhuǎn)染pcDNA3-NONO-HA組；④轉(zhuǎn)染pcDNA3-NONO—HA后,LPS刺激細(xì)胞12h。裂解細(xì)胞獲取總蛋白,用Western-Blot技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組SOD2表達(dá)水平。結(jié)果顯示,LPS刺激下NONO可以提高SOD2表達(dá)水平。
　　 (四)用RNAi技術(shù)檢測(cè)NONO被干擾后,RA

16、W264.7細(xì)胞中SOD2表達(dá)水平的變化。
　　 為了進(jìn)一步確定NONO可以上調(diào)SOD2表達(dá)水平,利用RNAi技術(shù)從反面驗(yàn)證NONO表達(dá)被干擾后,SOD2表達(dá)水平是否下降。實(shí)驗(yàn)分組:①轉(zhuǎn)染siRNA-NONO組；②轉(zhuǎn)染siRNA-NC組；③儀用轉(zhuǎn)染試劑處理組；④未加任何處理組。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,NONO被siRNA干擾后,SOD2表達(dá)水平相應(yīng)下降。
　　 至此,我們可以得出以下結(jié)論:①NONO可以上調(diào)小鼠SOD2啟

17、動(dòng)子活性；②NONO過表達(dá)可以增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的SOD2表達(dá)。
　　 (五)利用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)參與NONO調(diào)控SOD2基因表達(dá)的關(guān)鍵啟動(dòng)子區(qū)域首先,構(gòu)建小鼠SOD2啟動(dòng)子不同deletion片段驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因載體。將小鼠SOD2啟動(dòng)子從5’端依次遞減200bp后,分成8個(gè)片段:Ⅰ-1554～+48bp命名為sod2p；Ⅱ-1354～+48bp命名為sod2p-1；Ⅲ-1154～+48bp命名為sod2p-2；Ⅳ

18、-954～+48bp命名為sod2p-3；Ⅴ-754～+48bp命名為sod2p-4；Ⅵ-554～+48bp命名為sod2p-5；Ⅶ-354～+48bp命名為sod2p-6；Ⅷ-154～+48bp命名為sod2p-7。由這8個(gè)啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因載體分別命名為pGL3-sod2p、pGL3-sod2p-1、pGL3-sod2p-2、pGL3-sod2p-3、pGL3-sod2p-4、pGL3-sod2p-5、pGL3-sod

19、2p-6、pGL3-sod2p-7。
　　 然后,將8個(gè)報(bào)告基因載體分別與質(zhì)粒pGL3-control、pcDNA3-C-HA、pcDNA3-NONO-HA、pRL-TK共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞24h后,檢測(cè)細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,pcDNA3-NONO-HA與SOD2啟動(dòng)子不同deletion片段共轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性均顯著升高,除外SOD2p-7與pcDNA3-NONO-HA共轉(zhuǎn)染組。這一結(jié)果說明

20、,過表達(dá)的NONO蛋白均可以增強(qiáng)SOD2啟動(dòng)子不同deletion片段的轉(zhuǎn)錄活性,除外-154～+48bp這段啟動(dòng)子(-154～+48bp這段啟動(dòng)子幾乎沒有轉(zhuǎn)錄活性),提示我們NONO可能在SOD2基因-354～-154bp區(qū)域內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　 (六)分別使用p38MAPK、JNK、ERK磷酸化通路抑制劑處理RAW264.7細(xì)胞后,從蛋白水平檢測(cè)LPS刺激下NONO對(duì)SOD2表達(dá)水平的影響。
　　 為了探討LP

21、S刺激下NONO促使SOD2表達(dá)水平增高的分子機(jī)制,我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為5組:①轉(zhuǎn)染pcDNA3-NONO—HA組；②轉(zhuǎn)染pcDNA3-NONO-HA及p38 MAP kinase抑制劑SB203580處理組；③轉(zhuǎn)染pcDNA3-NONO-HA及JNK(c-Jun N-terminal kinase)抑制劑SP600125處理組；④轉(zhuǎn)染pcDNA3-NONO—HA及ERK(MAP kinase)抑制劑PD98059處理

22、組；⑤轉(zhuǎn)染pcDNA3-NONO-HA及DMSO處理組。轉(zhuǎn)染后24h,撤FBS6h,之后用各磷酸化通路抑制劑及DMSO預(yù)處理細(xì)胞1h,以終濃度為1μg/ml向培養(yǎng)基內(nèi)加入LPS,刺激12h。收細(xì)胞,裂解后獲取總蛋白,用Western-Blot技術(shù)檢測(cè)各處理組SOD2表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與①、⑤對(duì)照組相比,用p38 MAP kinase抑制劑SB203580處理細(xì)胞后,LPS誘發(fā)的NONO介導(dǎo)的SOD2高表達(dá)現(xiàn)象很大程度上被該抑制劑所消除

23、,而JNK(c—Jun N-terminal kinase)抑制劑SP600125、ERK(MAP kinase)抑制劑PD98059對(duì)NONO介導(dǎo)的LPS誘發(fā)的SOD2高表達(dá)幾乎無影響,與對(duì)照組SOD2表達(dá)量相似。這一結(jié)果提示我們LPS誘導(dǎo)的NONO介導(dǎo)的SOD2高表達(dá)可能與p38MAPK磷酸化通路有關(guān),鑒于NONO蛋白是一種多磷酸化蛋白,它是否受p38MAPK磷酸化需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 通過以上研究,我們可以得出以下結(jié)論:

24、
　　 1.NONO可以增強(qiáng)SOD2啟動(dòng)子活性；
　　 2.NONO可以上調(diào)LPS誘導(dǎo)的SOD2表達(dá)水平；
　　 3.NONO可能與SOD2啟動(dòng)子-354～-154bp區(qū)域相互作用,參與SOD2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此結(jié)論有待于EMSA和CHIP進(jìn)一步驗(yàn)證；
　　 4.LPS刺激下,NONO使SOD2表達(dá)水平增高,與p38MAPK磷酸化通路磷酸化某些蛋白質(zhì)有關(guān)。被磷酸化的蛋白是否是NONO需要進(jìn)一步驗(yàn)證。