SOD2及其單核苷酸多態(tài)性對(duì)耳蝸毛細(xì)胞氧化損傷影響的研究.pdf

1、近年來(lái)噪聲性聽(tīng)力損失(Noise Induced Hearing loss，NIHL)在世界各國(guó)發(fā)病率居高不下，我國(guó)每年新增的職業(yè)病病例中有1/6來(lái)自于職業(yè)性NIHL。目前關(guān)于NIHL的發(fā)生機(jī)制國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)形成共識(shí)，噪聲引起耳蝸聲音轉(zhuǎn)換、血管紋保持離子平衡及外毛細(xì)胞(Outer Hair Cells，OHI)對(duì)基底膜調(diào)節(jié)等耗能活動(dòng)增多，同時(shí)產(chǎn)生大量的活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)誘發(fā)的耳蝸氧化應(yīng)

2、激損傷是NIHL的基本病理過(guò)程。 線粒體作為產(chǎn)生能量的細(xì)胞器消耗體內(nèi)90％的氧并產(chǎn)生大量的氧自由基，如果這些活性氧不能被及時(shí)清除就有可能引起線粒體和其他細(xì)胞器的損傷。錳超氧化物歧化酶(Manganese Superoxide Dismutase，SOD2)主要分布于線粒體基質(zhì)內(nèi)，是線粒體內(nèi)唯一能將超氧陰離子(O2-·)催化為過(guò)氧化氫(H2O2)的酶，后者則在過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutat

3、hione Peroxidase，GPx)的作用下降解為水。作為清除自由基的關(guān)鍵酶，人們對(duì)，SOD2在氧化損傷中的作用目前尚無(wú)統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為高水平的SOD2可以促進(jìn)超氧陰離子的降解，從而保護(hù)組織細(xì)胞免受自由基攻擊。但部分學(xué)者根據(jù)不少氧化應(yīng)激相關(guān)疾病患者組織或血漿SOD2活力上升的事實(shí)，認(rèn)為高水平的SOD2催化超氧陰離子生成大量的H2O2，當(dāng)H2O2水平超過(guò)下游CAT、GPx的降解能力時(shí)，就會(huì)促進(jìn)細(xì)胞器和組織氧化損傷的發(fā)展。

4、 編碼SOD2信號(hào)肽(線粒體靶向序列，MTS)的基因序列存在單核苷酸多態(tài)性。其編碼序列第16位密碼子有GCT(丙氨酸，Ala)和GTT(頡氨酸，Val)的互換，即C47T變異(dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)收錄號(hào)：rs4880)。該SNP導(dǎo)致位于SOD2 MTS第16位氨基酸殘基丙氨酸(Ala)被纈氨酸(Val)替代。有關(guān)研究顯示該氨基酸殘基在SOD2靶向定位于線粒體過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，Ala16→Val16的替換使MTS構(gòu)像從α—螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣隆?/p>

5、片層，信號(hào)肽以丙氨酸作為16位氨基酸時(shí)，SOD2線粒體靶向效率明顯高于以纈氨酸作為16位氨基酸者，人群研究結(jié)果顯示該基因位點(diǎn)多態(tài)性與很多疾病均有關(guān)系但結(jié)論不一致。我們前期研究了SOD2單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)接噪工人NIHL易感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C47T變異與NIHL易感性有關(guān)，該位點(diǎn)攜帶的C等位基因(Ala16，較高的SOD2線粒體靶向效率)是NIHL的危險(xiǎn)因素，但這一研究結(jié)果與國(guó)外此前的報(bào)道并不一致。 鑒于SOD2及其基因多態(tài)性

6、與NIHL易感性關(guān)系的研究現(xiàn)況以及傳統(tǒng)的人群和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法的不足，本研究擬從NIHL的氧化損傷機(jī)制入手，構(gòu)建SOD2C47T變異高表達(dá)細(xì)胞株，利用有機(jī)氧化劑叔丁基過(guò)氧化氫(tert—Butyl Hydroperoxide，t—BHP)染毒耳蝸毛細(xì)胞HEI—OC1(House Ear Institue—Organ of Corti 1)建立毛細(xì)胞氧化損傷模型，在細(xì)胞水平上驗(yàn)證SOD2單核苷酸多態(tài)性與耳蝸毛細(xì)胞氧化損傷的關(guān)系，為SOD2及其

7、SNP與NIHL的關(guān)系提供更直接的科學(xué)線索。 研究目的: (1)建立HEI—OC1細(xì)胞氧化損傷模型。 (2)構(gòu)建高表達(dá)SOD2C47T變異A型和V型等位基因的小鼠耳蝸毛細(xì)胞模型。 (3)評(píng)價(jià)SOD2及其C47T變異在耳蝸毛細(xì)胞氧化損傷中的作用，為NIHL遺傳易感性的研究提供線索。 (4)為評(píng)價(jià)其他抗氧化酶基因與耳蝸毛細(xì)胞氧化損傷和NIHL易感性的關(guān)系建立體外研究方法。 研究方法:

8、(1)建立耳蝸毛細(xì)胞氧化損傷模型：光鏡觀察掌握HEI—OC1細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線；采用t—BHP染毒，設(shè)置從30μM到4000μM8個(gè)染毒濃度組對(duì)HEI—OC1細(xì)胞染毒12h，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率，并繪制細(xì)胞染毒濃度—存活率曲線和100μM濃度組染毒時(shí)間—存活率曲線；MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變；DCFH—DA探針?lè)z測(cè)胞內(nèi)ROS水平。通過(guò)上述方法篩選出既能在胞內(nèi)引起較高水平的ROS又對(duì)細(xì)胞存活、增殖、

9、形態(tài)改變等方面影響較小的染毒濃度和染毒時(shí)間。 (2)構(gòu)建SOD2基因多態(tài)性耳蝸毛細(xì)胞：野生型SOD2(第47位堿基為T(mén))全長(zhǎng)ORF(OpenReadingFrame，ORF)哺乳動(dòng)物表達(dá)克隆為廣州復(fù)能基因公司現(xiàn)貨，將SOD2野生型ORF序列通過(guò)定點(diǎn)突變后接入該真核表達(dá)載體，即可得突變型SOD2(第47位堿基為C)全長(zhǎng)ORF哺乳動(dòng)物表達(dá)克隆，該載體已引入Flag標(biāo)簽，可以表達(dá)C端Flag標(biāo)簽融合蛋白。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將上述兩種表達(dá)

10、克隆和空對(duì)照克隆導(dǎo)入HEI—OC1細(xì)胞，采用RT—PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄水平，QuantityOne圖像分析軟件做半定量分析，采用間接免疫熒光法(IndirectImmunoFluorescenceAnalysis，IIFA)檢測(cè)其融合蛋白表達(dá)并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。 (3)SOD2基因變異對(duì)HEI—OC1細(xì)胞氧化損傷的影響：MTT法檢測(cè)SOD2轉(zhuǎn)染對(duì)HEI—OC1細(xì)胞增殖能力的影響；黃嘌呤氧化法檢測(cè)轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組胞內(nèi)SOD2活性差異；染毒后

11、，DCFH—DA探針?lè)z測(cè)各組ROS水平差異；膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV)與碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)雙標(biāo)記后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞早期凋亡和壞死＼晚期凋亡差別。 研究結(jié)果: (1)不同濃度的t—BHP對(duì)耳蝸毛細(xì)胞染毒12h后，100μM以上濃度組細(xì)胞存活率開(kāi)始出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降，其中200μM—2000μM濃度組細(xì)胞存活率呈直線下降。100μM染毒時(shí)間—存活率曲線較為平緩。MTT實(shí)

12、驗(yàn)提示30μM的t—BHP染毒可以促進(jìn)耳蝸毛細(xì)胞增殖，200μM以上各濃度組則抑制細(xì)胞增殖。DCFH—DA探針?lè)z測(cè)胞內(nèi)ROS水平顯示：無(wú)染毒細(xì)胞鏡下無(wú)熒光(—)、陽(yáng)性對(duì)照為強(qiáng)熒光(+)、30μM和50μM濃度組則有弱熒光(—+)、100μM染毒組為強(qiáng)明亮熒光(++)、200μM-1000μM各組也有熒光，但隨著存活率的迅速降低視野下細(xì)胞稀疏。這提示100μMt—BHP對(duì)HEI—OC1細(xì)胞染毒12h可以很好的建立耳蝸毛細(xì)胞的氧化損傷模型

13、。 (2)DNA測(cè)序結(jié)果顯示野生型(Val16)和突變型(Ala16)SOD2哺乳動(dòng)物表達(dá)克隆已被成功構(gòu)建。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEI—OC1后，RT—PCR顯示野生型和突變型SOD2克隆已經(jīng)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)水平均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于試劑盒陽(yáng)性對(duì)照(2×105copies/μl)，其與內(nèi)參相對(duì)灰度值分別為：1.20±0.27和1.16±0.26，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IIFA顯示野生型和突變型SOD2克隆已經(jīng)成功表達(dá)Flag標(biāo)簽融合蛋白，經(jīng)計(jì)

14、算，其轉(zhuǎn)染效率分別為60.2±6.4％，64.2±7.0％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3)MTT法顯示SOD2表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不影響HEI—OC1細(xì)胞的增殖能力；轉(zhuǎn)染后，各組HEI—OC1胞內(nèi)SOD2酶活力分別為(U/ml)：未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，10.5±2.6；空質(zhì)粒對(duì)照組，11.7±1.3；Ala16SOD2轉(zhuǎn)染組，36.9±2.3；Val16SOD2轉(zhuǎn)染組，39.0±5.2。Ala16SOD2和Val16SOD2轉(zhuǎn)染組SOD2活

15、力分別是轉(zhuǎn)染對(duì)照組的3.51和3.71倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩種不同基因型間SOD2活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (4)100μMt—BHP對(duì)未轉(zhuǎn)染對(duì)照、空質(zhì)粒對(duì)照、Ala16型SOD2轉(zhuǎn)染(突變克隆)、Val16型SOD2轉(zhuǎn)染(野生克隆)HEI—OC1細(xì)胞染毒12h后，DCFH—DA探針檢測(cè)各組細(xì)胞ROS水平，未轉(zhuǎn)染對(duì)照、空質(zhì)粒對(duì)照組絕大部分細(xì)胞均發(fā)出++級(jí)明亮熒光，Ala16型和Val16型SOD2轉(zhuǎn)染組中均只有一半左右細(xì)胞發(fā)出—

16、+～+級(jí)別的模糊熒光，顯示轉(zhuǎn)染SOD2可以抑制t—BHP引起HEI—OC1胞內(nèi)ROS水平的上升。AnnexinV\PI雙染HEI—OC1細(xì)胞后經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞早期凋亡率和壞死＼晚期凋亡率分別為(％)：未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，20.5±2.8和17.9±1.3；Ala16SOD2轉(zhuǎn)染組，10.4±1.0和6.8±2.8；Val16SOD2轉(zhuǎn)染組，10.2±0.7和6.3±0.1。和未轉(zhuǎn)染對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染SOD2后，HEI—OC1細(xì)胞早期凋亡率和壞

17、死＼晚期凋亡率均下降(P<0.001)，但是其在SOD2兩種基因型之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 研究結(jié)論: (1)100μM的t—BHP對(duì)HEI—OC1細(xì)胞染毒12h可以在不影響細(xì)胞外形、增殖能力的前提下較為顯著地提高胞內(nèi)ROS水平，從而模擬噪聲對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。 (2)成功構(gòu)建了高表達(dá)SOD2C47T變異Ala16型和Val16型等位基因的耳蝸毛細(xì)胞株。 (3)SOD23.71倍以