基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的圓紅冬孢酵母遺傳重組系統(tǒng)的研究.pdf

1、圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)可在胞內(nèi)積累油脂、類(lèi)胡蘿卜素等，具有工業(yè)化應(yīng)用潛力。為改善其生產(chǎn)性狀及研究相關(guān)分子機(jī)制，需要建立有效的遺傳操作系統(tǒng)。目前已獲得了R.toruloides的多組學(xué)信息，并建立了基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)的方法。然而，在R.toruloides中非同源末端連接(Non-ho

2、mologous end joining，NHEJ)機(jī)制占主導(dǎo)，難以利用成熟的同源重組(Homologous recombination，HR)技術(shù)進(jìn)行靶基因敲除，而基于ATMT技術(shù)只能隨機(jī)整合外源基因，并且仍存在流程長(zhǎng)、篩選標(biāo)記有限等突出問(wèn)題。針對(duì)上述問(wèn)題，在R.toruloides中建立基于重組機(jī)制的遺傳操作方法:探索通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)同源重組來(lái)進(jìn)行靶基因敲除;建立位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行多基因整合。主要研究?jī)?nèi)容及成果如下:
　　

3、1)ATMT介導(dǎo)同源重組敲除靶基因。選擇八氫番茄紅素脫氫酶基因CRTI作為靶基因，設(shè)計(jì)并構(gòu)建帶有CRTI同源臂的潮霉素(HYG)表達(dá)盒敲除載體pZPK-CRT-H，以R.toruloides的單倍體NP11為出發(fā)菌株，采用ATMT技術(shù)進(jìn)行染色體整合，構(gòu)建CRTI基因敲除菌NP11-ΔCRT.結(jié)果顯示，約2％的轉(zhuǎn)化子呈白色表型，不能合成類(lèi)胡蘿卜素，并且在其基因組DNA樣品中未檢測(cè)到完整的CRTI基因。分別構(gòu)建強(qiáng)啟動(dòng)子PGPD和PADH2控

4、制CRTI表達(dá)的載體pZPK-CRT-1和pZPK-CRT-2對(duì)NP11-ΔCRT進(jìn)行基因回補(bǔ)，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生了具有類(lèi)胡蘿卜素合成能力的紅色轉(zhuǎn)化子，回補(bǔ)菌株胞內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素含量為309μg/g，與出發(fā)菌株NP11相比提高了30％.上述研究表明，在R.toruloides中基于同源重組的基因打靶效率極低，明確了CRTI的功能，并為改造R.toruloides提供了一個(gè)新的篩選標(biāo)記基因。
　　2)構(gòu)建基于Cre/loxP技術(shù)的位點(diǎn)特異性重組

5、系統(tǒng)。構(gòu)建三種類(lèi)型的HYG和博來(lái)霉素(BLE)雙抗性雙表達(dá)盒載體進(jìn)行載體功能驗(yàn)證，其中正向連接的雙表達(dá)盒載體pZPK-H-BLE-2通過(guò)ATMT技術(shù)驗(yàn)證了載體的功能;用重組酶基因替換pZPK-H-BLE-2上的BLE，構(gòu)建重組酶表達(dá)載體(pZPK-H-GPD-CRE，pZPK-H-GPD-CREP)及帶有BLE表達(dá)盒的重組位點(diǎn)載體(pZPK-Loxp-B).其中重組酶基因Crep從pSH65上擴(kuò)增而來(lái)，而Cre為根據(jù)R.toruloid

6、es密碼子偏好性重新設(shè)計(jì)并合成的重組酶基因。將重組位點(diǎn)和重組酶載體依次轉(zhuǎn)化至NP11中，發(fā)現(xiàn)表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)化子不能在含有博來(lái)霉素的平板上生長(zhǎng)，該表型符合loxP重組位點(diǎn)間BLE抗性基因被刪除的預(yù)期結(jié)果。上述結(jié)果表明，在R.toruloides中，成功建立了基于Cre/loxP技術(shù)的基因重組操作方法。
　　3)構(gòu)建并完善基于FLP/FRT技術(shù)的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。分別構(gòu)建重組酶載體pZPK-H-GPD-FLP及重組位點(diǎn)載體pZPK-

7、FRT-B，依次轉(zhuǎn)化至NP11中，未能獲得FRT重組位點(diǎn)間抗性基因被刪除的表型。分析挖掘R.toruloides核定位序列信息，提出融合表達(dá)重組酶FLP和轉(zhuǎn)錄因子RHTO_01582的核定位信號(hào)序列NLS3的思路，構(gòu)建內(nèi)源核定位信號(hào)融合重組酶表達(dá)載體pZPK-GPD-FLP-NLS3，再通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至整合了重組位點(diǎn)表達(dá)盒的R.toruloides工程菌NP11-FRT-B中，成功獲得了表型符合FRT重組位點(diǎn)間抗性基因刪除的轉(zhuǎn)化子，

8、從而初步建立了基于FLP/FRT的重組方法。為精確控制FLP的表達(dá)，分別構(gòu)建了抗生素自敲除載體pZPK-FRT-NAT-ADH2-FLP-NLS3及誘導(dǎo)型表達(dá)的FLP工程菌NP11-H-ADH2-FLP-NLS3，使FLP在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)表達(dá)，能夠通過(guò)重組來(lái)刪除抗性基因。在R.toruloides中建立并完善了基于FLP/FRT技術(shù)的基因重組系統(tǒng)，為更復(fù)雜的基因操作奠定了基礎(chǔ)。
　　4)FLP/FRT重組酶系統(tǒng)的應(yīng)用。

9、構(gòu)建帶有重組位點(diǎn)的功能基因雙表達(dá)盒載體pZPK-FRT-NAT/BLE-gene，轉(zhuǎn)化至工程菌NP11-H-ADH2-FLP-NLS3中，通過(guò)FLP的誘導(dǎo)表達(dá)，刪除了抗生素標(biāo)記基因，建立了標(biāo)記基因循環(huán)使用的方法。將甲醇利用途徑4個(gè)關(guān)鍵基因(MDH,HPS,PHI,PTA)，依次整合到R.toruloides染色體上，獲得了染色體整合表達(dá)五個(gè)外源基因的R.toruloides工程菌。將來(lái)源于三孢布拉霉Blakeslea trispora)

10、的類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)基因(CarB，CarRP)整合至CRTI基因缺失菌株NP11-ΔCRT中，工程菌株重新獲得了類(lèi)胡蘿卜素合成能力。為考察FLP/FRT技術(shù)在其它紅酵母中應(yīng)用的可行性，基于ATMT將FLP/FRT系統(tǒng)表達(dá)元件分別整合至海洋紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa，CGMCC2.1515)和紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides，CGMCC2.1609)中，獲得了染色體整合外源基因