普洱茶發(fā)酵微生物的溯源分析.pdf

1、普洱茶為中國(guó)特色的傳統(tǒng)發(fā)酵茶，歷史悠久。普洱茶發(fā)酵過(guò)程中的微生物對(duì)其品質(zhì)的形成有著重要的貢獻(xiàn)。普洱茶獨(dú)特的品質(zhì)風(fēng)味是經(jīng)過(guò)其茶葉本身與其發(fā)酵過(guò)程中的微生物共同作用的結(jié)果。不同普洱茶產(chǎn)區(qū)所產(chǎn)出的成品茶其品質(zhì)風(fēng)味各有特色，然而各產(chǎn)區(qū)選用的原料茶的品種并無(wú)較大差異，所以為了研究這些差異產(chǎn)生的原因，對(duì)普洱茶發(fā)酵微生物進(jìn)行了溯源分析研究，重點(diǎn)研究普洱茶原料茶生長(zhǎng)環(huán)境中的空氣微生物、茶葉內(nèi)生菌以及發(fā)酵車(chē)間中的環(huán)境微生物。本文采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和分子生物學(xué)相

2、結(jié)合的研究方法對(duì)云南省普洱茶樹(shù)良種場(chǎng)的三個(gè)茶山的空氣微生物、茶山上茶樹(shù)葉片內(nèi)生菌以及發(fā)酵車(chē)間中的環(huán)境微生物進(jìn)行了采集、分離純化與鑒定和微生物群落分析，研究結(jié)果顯示普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中的微生物有一部分是來(lái)自于茶葉生長(zhǎng)環(huán)境中的空氣微生物、茶葉內(nèi)生菌和普洱茶發(fā)酵車(chē)間。本文的研究?jī)?nèi)容主要有以下幾個(gè)部分:
　　 1.對(duì)普洱茶生長(zhǎng)環(huán)境的空氣微生物進(jìn)行了采集與鑒定，采用固體撞擊法和濾膜過(guò)濾法。固體撞擊法是利用安德森空氣微生物采樣器對(duì)云南普洱茶

3、樹(shù)良種場(chǎng)的三個(gè)茶山進(jìn)行了空氣微生物的采集，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。分三次取樣，在24℃和45℃兩個(gè)溫度下培養(yǎng)，進(jìn)行分離、純化和鑒定。濾膜過(guò)濾法是用濾膜采樣器將空氣微生物采集到濾膜上，經(jīng)過(guò)菌體洗脫、DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序分析等步驟，初步確定該地區(qū)普洱茶生長(zhǎng)環(huán)境中空氣微生物的種類(lèi)及各種類(lèi)所占數(shù)量比例，為探究普洱茶發(fā)酵微生物的來(lái)源提供一定的數(shù)據(jù)支持。
　　 2.對(duì)新鮮茶葉中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定。采集新鮮健康的茶樹(shù)葉片，

4、在無(wú)菌條件下用組織粉碎機(jī)粉碎，涂布，培養(yǎng)，分離純化，采用了與培養(yǎng)空氣微生物相同的四種培養(yǎng)基，最后經(jīng)分子生物學(xué)研究方法鑒定出9種微生物，其中在空氣微生物中出現(xiàn)的有4種，分別是:禾谷鐮刀菌Fusarium asiaticum和Wickerhamomyces anomalus、Bacteroidetesbacterium、樹(shù)枝狀孢菌Cladosporium cladosporioides。
　　 3.采集、分離并鑒定普洱茶發(fā)酵環(huán)境中的

5、微生物。車(chē)間中環(huán)境微生物的來(lái)源主要有三個(gè)方面:車(chē)間空氣、地面、發(fā)酵用水。在普洱茶渥堆發(fā)酵前的車(chē)間進(jìn)行取樣，采用LB和YEPD兩種培養(yǎng)基，在不同溫度(25℃、37℃、45℃、55℃)恒溫下培養(yǎng)2-3天，對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)、分離、純化及保存，并將純化后的微生物菌落進(jìn)行PCR反應(yīng)，測(cè)序，確定微生物的種類(lèi)。最終鑒定出12種微生物，其中有6種微生物在普洱茶渥堆發(fā)酵微生物中也有發(fā)現(xiàn)，分別是微小根毛霉Rhizomucor pusilus、埃默森籃狀菌T

6、alaromyces emersonii、塔賓曲霉Aspergillus tubingensis、疏棉嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus、黑曲霉Aspergillus niger以及煙曲霉Aspergillus fumigatus。
　　 4.對(duì)這三個(gè)來(lái)源的微生物進(jìn)行綜合分析，聯(lián)系本課題組對(duì)普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中的微生物的研究成果，確定其發(fā)酵微生物有一部分來(lái)源于普洱茶生長(zhǎng)環(huán)境中的空氣微生物、茶葉內(nèi)生菌以及發(fā)酵