尿液exosomes的分離、富集、純化及其內(nèi)部蛋白指紋圖譜分析.pdf

1、研究背景:
　　1987年，Johnstone等在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟過程中，通過羊網(wǎng)織紅細(xì)胞體外培養(yǎng)的上清超速離心后，收集到一種直徑60 nm的囊性小泡，其將這些納米級的小囊泡即命名為exosomes。exosomes由脂質(zhì)雙分子層、跨膜蛋白、mRNAs和microRNAs組成，密度在1.13ug/ml到1.19g/ml之問，在電子顯微鏡下呈杯狀。
　　近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，尿液exosomes蛋白譜的變化可以反映某些特定

2、的腎臟病變情況。Exosomes可以攜帶信息穿梭于腎臟細(xì)胞之問，改變受體細(xì)胞蛋白譜與功能，這可能代表著一種腎單位內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞間的信號傳遞機(jī)制。
　　近年來結(jié)合尿exosomes分離技術(shù)及先進(jìn)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)檢測出不少腎臟結(jié)構(gòu)與功能損害相關(guān)的尿exosomes生物標(biāo)記物。尿液exosomes的發(fā)現(xiàn)對糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制、早期診斷和監(jiān)測標(biāo)記物的研究帶來了新的方向。
　　尿液exosomes給腎臟病等泌尿系統(tǒng)疾病的研究帶來了極大

3、的前景，但日前還處于初期階段，很多研究中面臨的問題與挑戰(zhàn)有待解決。
　　首當(dāng)其沖的就是尿液exosomes的分離、富集和純化問題。到目前為止還沒有統(tǒng)一的得到一致認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)方法。
　　本研究團(tuán)隊經(jīng)過兩年的前期研究創(chuàng)立了一種新的exosomes分離、富集方法-“液壓透析法(hydrostatic dialysis)”。該方法具有設(shè)備簡單、成本低、處理量大，尿液中干擾性的可溶性蛋白有效清除，排除個體間exosomes外其它因素差異

4、對后續(xù)生物學(xué)分析的影響（如不同尿液來源的酸堿程度差異在本方法處理后處在同一PH水平），最大程度減少了exosomes的損失，而且可以與超速離心、超濾方法上述兩種分離、富集方法相結(jié)合用于不同目的的研究等主要優(yōu)點。該方法在大規(guī)模推廣應(yīng)用前需要進(jìn)一步通過中國人群不同腎病程度的尿液標(biāo)本來驗證該方法的可重復(fù)性與有效性。另外我們將在此方法分離、富集尿液exosomes基礎(chǔ)上探討可作為尿液exosomes成分標(biāo)準(zhǔn)化的候選指標(biāo)。同時，進(jìn)一步應(yīng)用還原、烷

5、基化、Trypsin酶解等方法探索對尿液exosomes的完全純化（即完全清除exosomes外的干擾蛋白）。在純化的尿液exosomes基礎(chǔ)上，通過質(zhì)譜分析了解尿液exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜。
　　方法:
　　1.尿液標(biāo)本的選取與收集
　　“液壓透析法”驗證研究標(biāo)本從-80℃超低溫冰箱所保存的中國人群尿液樣本庫中選取，包括正常人群組、前驅(qū)糖尿病組、糖尿病無蛋白尿組、糖尿病微量白蛋白尿組、糖尿病大量蛋白尿組尿液樣

6、本。
　　標(biāo)準(zhǔn)化、純化及質(zhì)譜分析研究選取都柏林城市大學(xué)健康志愿者提供的尿液標(biāo)本。所有入組對象均簽署經(jīng)都柏林城市大學(xué)國家生物傳感器中心倫理委員會批準(zhǔn)的知情同意書。收集研究對象晨起第一次尿液樣本，不添加蛋白酶抑制劑及防腐劑，2小時內(nèi)送實驗室處理。
　　2.“液壓透析法”尿exosomes的分離、富集
　　尿液標(biāo)本先室溫下2000g離心30分鐘，除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片、及部分Tamm-Horsfall蛋白。上清液通過白行設(shè)計的液

7、壓透析裝置進(jìn)行exosomes分離、富集:檢查裝置連接良好后，將尿液標(biāo)本倒入該裝置，待樣品濃縮至6-8ml時，加入200ml miliQ水，沖洗1000KD透析膜。待樣品進(jìn)一步濃縮至6-8ml時收集1000KD透析膜內(nèi)的液體(↑1000KDa fraction)。
　　3.尿exosomes的鑒定
　　透射電子顯微鏡觀察“液壓透析法”分離、富集的↑1000KDa部分液體中是否存在囊泡，囊泡的形狀、大小。通過western b

8、lot檢測尿exosomes自身的標(biāo)記物TSG101。
　　4.探討尿液exosomes相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化（量化）指標(biāo)
　　探討Tamm-Horsfall蛋白以及白蛋白這兩種指標(biāo)在尿液exosomes相關(guān)檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的應(yīng)用可行性。10位健康人尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品(↑1000KDa)，通過western blot技術(shù)在同一塊膜上檢測Tamm-Horsfall蛋白與TSG101蛋白熒光信號以及白蛋白與TSG

9、101蛋白熒光信號，利用Odyssey掃描系統(tǒng)自帶的軟件定量分析熒光信號強(qiáng)度。使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包對10份樣品的灰度值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。應(yīng)用Spearman秩相關(guān)系數(shù)來分析THP與TSG101灰度值，以及Albumin與TSG101灰度值之間的相關(guān)關(guān)系，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.還原與烷基化反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除
　　Tamm-Horsfall蛋白的多聚體結(jié)構(gòu)中富含二硫鍵。利

10、用還原與烷基化試劑對二硫鍵破壞，觀察其對尿液exosoems外部干擾蛋白（特別是Tamm-Horsfall蛋白的降解與清除情況）以及對exosomes的影響，為exosomes的純化研究提供指導(dǎo)。
　　6.Trypsin酶解反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除及exosomes的純化
　　對尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品(↑1000KDa)進(jìn)行還原、烷基化及蛋白酶Trypsin酶解反應(yīng)。將外部的蛋白

11、（特別是Tamm-Horsfall蛋白）分解成肽段，再經(jīng)過截留分子量為30KD的超濾裝置進(jìn)行分離。利用凝膠考馬斯亮藍(lán)染色、western blot及透射電鏡觀察Tamm-Horsfall蛋白的分解及清除情況，以及對exosomes本身的影響。
　　7.在尿液exosomes純化的基礎(chǔ)上對exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜的分析
　　對尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品，利用上述方法進(jìn)行exosomes純化。然后使

12、用去污劑脫氧膽酸鈉破壞exosomes外膜，暴露exosomes內(nèi)部成分，再進(jìn)行還原、烷基化及Trypsin酶解蛋白，利用質(zhì)譜分析了解exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜。
　　結(jié)果:
　　1.新型尿液exosomes分離、富集技術(shù)的驗證
　　中國人群不同腎臟病變程度尿液樣品通過“液壓透析法”均可有效分離、富集exosomes，體現(xiàn)了很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。透射電鏡下可以觀察到↑1000KDa樣品中散在分布的大小不等的囊泡，

13、囊泡主要的直徑范圍為40-100nm，最小的囊泡直徑為20-30nm，最大的囊泡直徑可為400nm。Western blot檢測到exosomes自身的標(biāo)記物TSG101陽性，表明尿exosomes富集過程中exosomes未受到破壞。
　　2.尿液exosomes相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化（量化）指標(biāo)
　　通過Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描后的圖像通過Quantity-One圖像分析軟件掃描計算出條帶平均灰度值。Spearman秩

14、相關(guān)系數(shù)的分析結(jié)果顯示Tamm-Horsfall蛋白與TSG101熒光強(qiáng)度相關(guān)系數(shù)r=0.842，p=0.002，兩者之間具有正相關(guān)關(guān)系。
　　3.還原與烷基化反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除
　　凝膠考馬斯亮藍(lán)染色及western blot結(jié)果顯示，還原與烷基化反應(yīng)后exosomes外Tamm-Horsfall蛋白部分降解，但兩種還原及烷基化試劑在不同速度離心下均不能完全消除Tamm-Horsfall蛋白對ex

15、osomes的影響。
　　4.Trypsin酶解反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除及exosomes的純化
　　凝膠考馬斯亮藍(lán)染色及western blot結(jié)果顯示，還原、烷基化基礎(chǔ)上的Trypsin酶解反應(yīng)，可將exosomes外Tamm-Horsfall蛋白完全降解。通過截留分子量為30KD的超濾裝置可清除已降解的肽段，實現(xiàn)exosomes的純化。整個過程中exosome未受到破環(huán)。
　　5.在尿液exo

16、somes純化的基礎(chǔ)上對exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜的分析
　　在上述純化的exosomes的基礎(chǔ)上，對exosomes內(nèi)部成分進(jìn)行MS/MS分析，結(jié)果共鑒定出exosomes內(nèi)部942種蛋白質(zhì)并對鑒定的蛋白進(jìn)行了細(xì)胞組分、分子功能與生物過程的分析。
　　結(jié)論:
　　1.本研究團(tuán)隊所發(fā)明的“液壓透析法”能夠很好地分離、富集尿液中的exosomes，有著良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，適用于不同的實驗室、不同的人群以及不同的尿

17、液病理狀態(tài)，是一種值得廣泛推廣應(yīng)用的技術(shù)方法。
　　2.Tamm-Horsfall蛋白可以作為檢測尿液exosomes相關(guān)生物標(biāo)記物的候選標(biāo)準(zhǔn)化（量化）指標(biāo)。
　　3.應(yīng)用還原、烷基化及Trypsin酶解反應(yīng)結(jié)合超濾裝置能實現(xiàn)尿液exosomes的純化，再此基礎(chǔ)上鑒定可靠的exosomes內(nèi)部蛋白質(zhì)圖譜。
　　4.本研究建立了一套從尿液收集，到尿液exosomes分離、富集、純化及蛋白質(zhì)組學(xué)分析的一體化研究方法，為后續(xù)