載BMP-2多肽P24的磷酸鈣骨水泥微球支架材料的骨修復(fù)研究.pdf

1、目的:大范圍骨缺損通常由外傷、畸形和骨腫瘤等致病因素導(dǎo)致。自體骨移植和異體骨移植是臨床上治療骨缺損的常用方法，然而，由于骨移植物來源有限、供骨區(qū)并發(fā)癥、感染、排斥反應(yīng)等原因，其應(yīng)用受到限制。將P24多肽與磷酸鈣骨水泥微球復(fù)合，制備出新型載P24多肽的磷酸鈣骨水泥微球支架材料，研究該微球材料的因子釋放特點(diǎn)，體外細(xì)胞相容性、體外成骨誘導(dǎo)性能、體內(nèi)生物相容性和骨修復(fù)性能，旨在根據(jù)骨組織工程的應(yīng)用策略，尋找合適的生物活性因子，促進(jìn)骨組織工程骨填

2、充復(fù)合材料的發(fā)展，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論借鑒。
　　方法:本研究采用四鈣磷酸鹽和無水磷酸氫鈣制備磷酸鈣骨水泥，使用的P24多肽來源于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，其多肽序列為(N→C:KIPKA SSVPT ELSAISTLYL SGGC)。首先將P24溶解于鹽酸溶液(0.1 M)中，加入磷酸鈣粉末并持續(xù)攪拌直至混合均勻，采用液滴冷凝法制備出微球，再將微球置入微型球形模具中，采用冷凍干燥法進(jìn)行干燥處理(-50℃，20 Pa)即得到P24

3、/CPC微球。采用此法制備不同P24含量的磷酸鈣骨水泥微球支架材料(P24/CPC質(zhì)量比為0％、2％和4％)-CPC、2％ P24/CPC和4％ P24/CPC，用于后續(xù)的體內(nèi)體外研究。在體外，采用高性能液相色譜系統(tǒng)檢測P24/CPC微球的P24多肽釋放性能。將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于CPC、2％ P24/CPC及4％ P24/CPC微球支架材料上，置于DMEM培養(yǎng)基中（15％胎牛血清，1％青鏈霉素混合液）共培養(yǎng)，分別被采用掃描電鏡、

4、CCK-8法及DAPI熒光標(biāo)記法檢測細(xì)胞形態(tài)及增殖情況;采用qPCR檢測大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的成骨特異性基因(OCN和Runx2)的表達(dá)情況;檢測大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中堿性磷酸酶活性。動物實(shí)驗(yàn)包括大鼠異位成骨實(shí)驗(yàn)和兔股骨缺損骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)兩部分。首先，18只健康雌性SD大鼠（平均重量150 g，購于廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心），隨機(jī)分成A、B、C三組，每組6只，按照分組分別將CPC、2％ P24/CPC及4％ P24/CPC微球支架材料植入到大鼠

5、背部豎脊肌肌袋內(nèi)，術(shù)后4周、8周行電子計算機(jī)斷層掃描(CT)，蘇木質(zhì)伊紅染色(H&E染色)以及曼森染色檢測。最后，制備新西蘭大白兔股骨髁圓柱形股缺損模型，將CPC、2％ P24/CPC及4％ P24/CPC微球支架材料植入到骨缺損處，術(shù)后4周、8周、12周取股骨標(biāo)本，行電子計算機(jī)斷層掃描(CT)和組織學(xué)檢測，評估P24/CPC微球材料的骨修復(fù)性能。本研究所得的數(shù)據(jù)均為計量資料，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x0±SD)的形式來表示，在數(shù)據(jù)

6、整理后，采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計學(xué)分析選用析因分析或重復(fù)測量的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計處理，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)（Levene's檢驗(yàn)）結(jié)果選擇校正或不校正的F值和P值。對多因素數(shù)據(jù)中的某因素組間進(jìn)行比較，兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)及LSD多重比較，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)表明P24/CPC微球能夠保持P24多肽活性，并且持續(xù)釋放P2

7、4多肽超過39天。與對照組相比較，不同P24含量的磷酸鈣骨水泥微球(P24/CPC質(zhì)量比為2％和4％)能夠較好地支持大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的生長、增殖及材料表面粘附，增加細(xì)胞的堿性磷酸酶活性及提高成骨特異性基因(OCN和Runx2)的表達(dá)(P＜0.05)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)P24/CPC微球材料具備良好的細(xì)胞相容性，可以顯著促進(jìn)BMSCs的成骨分化。異位成骨實(shí)驗(yàn)中，CT結(jié)果提示，在術(shù)后4周，4％P24/CPC微球材料組大鼠背部組織

8、標(biāo)本的骨密度顯著高于其他組(P＜0.05);術(shù)后8周，A、B、C三組的大鼠背部組織標(biāo)本骨密度(BMD)值均有顯著提高(P＜0.05);組織學(xué)檢測表明，CPC、2％ P24/CPC及4％ P24/CPC微球支架材料體內(nèi)降解性能良好，術(shù)后4周、8周三組微球材料內(nèi)部均有血管長入，體內(nèi)炎癥反應(yīng)輕微，P24/CPC微球支架材料異位成骨程度顯著高于單純CPC微球支架材料。最后，兔股骨骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，CT結(jié)果表明術(shù)后4周、8周、12周，材料組的骨量

9、(BV)及骨密度(BMD)均高于空白組(P＜0.05)，4％ P24/CPC組的骨量(BV)及骨密度(BMD)高于CPC組(P＜0.05)，術(shù)后12周CPC、2％ P24/CPC及4％ P24/CPC組股骨缺損基本修復(fù)，組織學(xué)檢測結(jié)果提示CPC及P24/CPC微球降解性能良好，置入部位炎癥反應(yīng)輕微，材料組骨缺損修復(fù)結(jié)果滿意，其中P24/CPC微球材料骨修復(fù)性能最佳。
　　結(jié)論:磷酸鈣骨水泥微球是P24多肽的一種良好載體，磷酸鈣骨水