南方漢族終末期腎功能衰竭患者HLA基因及單倍型多態(tài)性分析.pdf

1、終末期腎功能衰竭(End-stage renal disease,ESRD)是指各種原因造成的慢性進(jìn)行性腎實(shí)質(zhì)損害,致使腎臟明顯萎縮,不能維持其基本功能,臨床出現(xiàn)以代謝產(chǎn)物潴留,水、電解質(zhì)、酸堿平衡失調(diào),全身各系統(tǒng)受累為主要表現(xiàn)的臨床綜合征,也稱(chēng)為尿毒癥。各種腎臟疾病持續(xù)進(jìn)展,最后均可導(dǎo)致終末期腎功能衰竭。據(jù)有關(guān)發(fā)達(dá)國(guó)家統(tǒng)計(jì),慢性腎衰的發(fā)病率與患病率均有上升趨勢(shì)。美國(guó)慢性腎衰患者的總數(shù)已達(dá)1363萬(wàn),其患病率為9.9％o,我國(guó)報(bào)道終末期

2、腎功能衰竭患者患病率也高達(dá)0.1‰。眾所周知,慢性腎衰是一種嚴(yán)重危害人民健康和生命的常見(jiàn)病,而且治療費(fèi)用昂貴,對(duì)家庭和社會(huì)都造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但其發(fā)病機(jī)制尚未清楚,除外目前解釋CRF的腎小球高灌注、高壓力、高濾過(guò),腎小球囊內(nèi)高壓,腎小管高代謝及腎臟代償性肥大等理論；腎小球和腎間質(zhì)的變化,腎小球、腎小管間質(zhì)細(xì)胞及腎臟浸潤(rùn)細(xì)胞產(chǎn)生的大量免疫炎性細(xì)胞因子,也參與了腎功能惡化的過(guò)程。
　　 人類(lèi)白細(xì)胞抗原系統(tǒng)是人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合

3、體(Major histocompatibitilycomplex,MHC),是編碼HLA的基因群,是人類(lèi)基因組計(jì)劃完成并公布的人體最復(fù)雜的免疫復(fù)合體。HLA分成三類(lèi)基因區(qū),Ⅰ類(lèi)基因包括經(jīng)典的A、B、C位點(diǎn),非典型區(qū)E、F、G位點(diǎn)等,在免疫系統(tǒng)中起識(shí)別自我和非我的功能,因此在免疫系統(tǒng)抵抗病毒和腫瘤中起重要作用；Ⅱ類(lèi)基因包括經(jīng)典區(qū)DP、DQ、DR.位點(diǎn),非典型區(qū)DN、DM、DO位點(diǎn)等,其編碼的產(chǎn)物主要與抗原的處理、加工和提呈有關(guān)；Ⅲ類(lèi)基因

4、包括包括C2、Bf、C4A、C4B等補(bǔ)體成分編碼基因和MIC、LTA、TNF、LTB、HSP70等,其中后者的表達(dá)產(chǎn)物與炎癥反應(yīng)有關(guān)。在1958年經(jīng)Dausset發(fā)現(xiàn),HLA便成為醫(yī)學(xué)界最活躍的研究領(lǐng)域之一,最終導(dǎo)致了一門(mén)新興的邊緣學(xué)科-免疫遺傳學(xué)的迅速發(fā)展。隨著研究的逐步深入,HLA在人體生理、病理機(jī)制中的重大作用越來(lái)越多地被證明,發(fā)現(xiàn)它不僅在移植排斥、免疫應(yīng)答的遺傳控制和調(diào)節(jié)、免疫細(xì)胞的相互識(shí)別和限制等方面有重要的意義,而且在與疾病

5、的相關(guān)性方面有著極其重要的臨床價(jià)值。
　　 腎臟病多數(shù)是免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)所致,在其發(fā)展過(guò)程中有很多免疫炎性因子的參與,如NK細(xì)胞,B細(xì)胞,T細(xì)胞,血小板,粒細(xì)胞等,這些免疫活性細(xì)胞需要HLA作為免疫反應(yīng)的配體與其細(xì)胞膜上的受體結(jié)合才能發(fā)揮免疫炎性反應(yīng)。而且有學(xué)者對(duì)腎衰患者進(jìn)行腎活檢發(fā)現(xiàn)腎小球系膜區(qū)有HLA-Ⅲ類(lèi)基因編碼的產(chǎn)物補(bǔ)體C4的沉積,這些均說(shuō)明HLA在腎臟病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。所以通過(guò)研究等候腎移植的終末期腎

6、功能衰竭患者HLA分型資料與健康人群的比較,尋找與ESRD存在易感的HLA基因及單倍型是非常有必要,而且具有實(shí)際臨床意義。近年來(lái)國(guó)外一些移植中心對(duì)HLA在導(dǎo)致各類(lèi)腎臟疾病最終進(jìn)展為終末期腎功能衰竭進(jìn)程中所起的免疫遺傳作用做了較多研究,并提出可能的易感基因和保護(hù)基因。Rogus JJ等通過(guò)家系研究提出1型糖尿病腎病患者并發(fā)終末期腎衰,易感基因在其發(fā)病中起重要作用,并提出易感基因可能位于人六號(hào)染色體短臂HLA區(qū)域。KARAHAN GE等報(bào)道

7、土耳其587例不同原發(fā)病最終并發(fā)終末期腎衰竭患者高表達(dá)HLA-B58,DR3,并認(rèn)為易感基因的確定可能對(duì)延緩腎臟疾病患者向ESRD進(jìn)展和預(yù)防移植后原發(fā)病再發(fā)有重要意義。
　　 國(guó)內(nèi)尚無(wú)大樣本資料研究HLA與ESRD的相關(guān)性。本課題以等候腎移植的終末期腎功能衰竭患者、正常健康人群為研究對(duì)象,采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction sequence specific primer,PCR-

8、SSP)技術(shù)檢測(cè)終末期腎功能衰竭患者HLA-A,B,DRB1基因分型及單倍型多態(tài)性,與健康人群進(jìn)行比較,探討HLA在因各類(lèi)腎臟病導(dǎo)致患者最終并發(fā)終末期腎功能衰竭進(jìn)程中的免疫遺傳易感性。
　　 第一章終末期腎功能衰竭患者HLA基因多態(tài)性分析
　　 目的:通過(guò)對(duì)等候腎臟移植的患者進(jìn)行HLA-A,B,DRB1基因表達(dá)的研究,與健康對(duì)照組相比較,以探討在因腎臟疾病導(dǎo)致患者最終并發(fā)終末期腎功能衰竭(End-stage renal

9、disease,ESRD)進(jìn)程中的HLA免疫遺傳易感性及其相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)作用。
　　 方法:對(duì)3911例終末期腎功能衰竭患者(病例組)和4707例無(wú)血緣關(guān)系隨機(jī)健康獻(xiàn)血者(對(duì)照組)采用PCR-SSP方法檢測(cè)兩組HLA-A,B,DRB1三個(gè)座位的基因分型。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)據(jù),HLA基因表現(xiàn)型頻率(phenotype frequencies,PF)=觀(guān)察到的HLA基因陽(yáng)性個(gè)數(shù)(n)/被研究人數(shù),基因頻率(gene f

10、requencies,GF)應(yīng)用公式GF=1-(1-PF)1/2計(jì)算。兩組基因表現(xiàn)型頻率、基因型頻率的比較采用四格表x2檢驗(yàn)。兩組比較的OR值通過(guò)Woolf公式計(jì)算。對(duì)P值計(jì)算其校正Pc值(以P值乘以所檢測(cè)的某一位點(diǎn)的抗原數(shù)即Pc值表示)。由于我們比較的抗原數(shù)較多,容易造成統(tǒng)計(jì)學(xué)上的Ⅰ類(lèi)誤差,即有可能完全由于機(jī)會(huì)而表現(xiàn)出HLA基因與ESRD有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián),故需校正P值,即P值乘以被比較的抗原數(shù),有時(shí)校正后仍會(huì)出現(xiàn)Ⅰ類(lèi)誤差,給合相關(guān)文

11、獻(xiàn),我們將Pc值設(shè)定為<1×10-5具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算均由SPSS13.0完成。
　　 結(jié)果:1、ESRD患者組檢出HLA-A位點(diǎn)基因19個(gè),對(duì)照組檢出17個(gè)。ESRD患者組比對(duì)照組多檢出的基因?yàn)锳*25和A*80。在ESRD患者組中HLA表型頻率顯著降低的是HLA—A*30(Pc<0.00001),未發(fā)現(xiàn)頻率顯著升高的基因。
　　 2、ESRD患者組檢出HLA-B位點(diǎn)基因41個(gè),對(duì)照組檢出38個(gè),僅在ESRD

12、患者組中檢出的基因?yàn)镠LA-B*28、B*42、B*72、B*78和B*73,僅在對(duì)照組中檢出的基因?yàn)镠LA-B*47和B*64。在ESRD患者組中表型頻率顯著升高的基因?yàn)镠LA-B*75(Pc<0.00001,OR=1.479,95％CI=1.315-1.664),未發(fā)現(xiàn)頻率顯著降低的基因。
　　 3、ESRD患者檢出HLA-DRB1位點(diǎn)基因14個(gè),對(duì)照組檢出13個(gè)。ESRD患者組比對(duì)照組多檢出的基因?yàn)镠LA-DR*18。在E

13、SRD患者組表型頻率顯著升高的基因?yàn)镠LA-DR*04(Pc<0.00001,OR=1.294,95％CI=1.172-1.428)、HLA-DR*17(Pc<0.00001,OR=2.639,95％CI=2.240-3.110),顯著降低的基因?yàn)镠LA-DR*08(Pc<0.00001,OR=0.697,95％CI=0.615-0.791)。
　　 結(jié)論：1.HLA在不同地區(qū),不同種族表現(xiàn)出與ESRD相關(guān)聯(lián)的易感基因和保護(hù)基因

14、不同。
　　 2.HLA-A*30雖然在病例組和對(duì)照組表型頻率比較中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但其在兩組中的頻率均較低,結(jié)合臨床,認(rèn)為其不與ESRD存在關(guān)聯(lián)。
　　 3.HLA-B*75、DR*04和DR*17可能對(duì)我國(guó)南方漢族腎臟疾病患者最終并發(fā)ESRD具有獨(dú)立易感關(guān)聯(lián),而表達(dá)HLA-DR8的腎臟病患者將可能延緩發(fā)生ESRD。
　　 4.我國(guó)南方漢族腎臟病患者可能并發(fā)ESRD的易感基因和保護(hù)基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于本地區(qū)等候腎臟移

15、植患者選擇合適供體,提高移植后患者生存時(shí)間和遠(yuǎn)期移植效果具有臨床指導(dǎo)意義。
　　 第二章HLA易感基因相應(yīng)單倍型與ESRD易感關(guān)聯(lián)分析
　　 目的：通過(guò)多中心大樣本等待腎移植受者的HLA分型資料與健康人群對(duì)照分析,發(fā)現(xiàn)HLA-B*75,DR*04,DR*17是終末期腎功能衰竭(End-stage renaldisease)的易感基因,在此基礎(chǔ)上分析與其相關(guān)單倍型在病例組和對(duì)照組的分布,探討與終末期腎功能衰竭存在易感關(guān)聯(lián)的

16、HLA單倍型。
　　 方法：應(yīng)用人口遺傳學(xué)軟件Arlequin統(tǒng)計(jì)分析ESRD患者組和對(duì)照組HLA兩位點(diǎn)單倍型頻率,通過(guò)卡方檢驗(yàn)篩選病例組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的單倍型,計(jì)算其優(yōu)勢(shì)比(odds ratio,OR)。對(duì)P值計(jì)算其校正Pc值(以P值乘以HLA每?jī)晌稽c(diǎn)所檢出的單倍型數(shù)即Pc值表示)。
　　 結(jié)果：1.ESRD患者組表達(dá)HLA易感基因B*75-A位點(diǎn)單倍型11條,對(duì)照組患者組表達(dá)HLA易感基因B*75-A位點(diǎn)單倍型7條。

17、僅在ESRD患者組中表達(dá)的單倍型為A*33-B*75,A*66-B*75,A*03-B*75,A*29-B*75,A*34-B*75,A*68-B*75(頻率分別為0.268％,0.051％,0.049％,0.046％,0.037％,0.022％)。僅在對(duì)照組表達(dá)的單倍型為A*30-B*75,A*25-B*75(頻率分別為0.057％,0.040％)。兩組對(duì)比,單倍型頻率未發(fā)現(xiàn)有顯著差異。
　　 2、ESRD患者組表達(dá)HLA易感

18、基因DR*04-B位點(diǎn)單倍型27條,僅在ESRD患者組中表達(dá)的單倍型為B*44-DR*04,B*37-DR*04,B*57-DR*04,B*81-DR*04,B*28-DR*04(頻率為0.166％,0.111％,0.061％,0.051％,0.013％)。對(duì)照組表達(dá)HLA易感基因DR*04-B位點(diǎn)單倍型25條,僅在對(duì)照組表達(dá)的單倍型為B*63-DR*04,B*49-DR*04,B*42-DR*04(頻率均為0.040％)。兩組對(duì)比,E

19、SRD患者組中單倍型頻率顯著升高(Pc<0.05)的是B*13-DR*04(1.149％vs0.043％),B*46-DR*04(1.952％ vs0.758％),B*58-DR*04(0.957％vs0.138％),B*75-DR*04(1.354％vs0.450％)。
　　 3、ESRD患者組表達(dá)HLA易感基因DR*17-B位點(diǎn)單倍型31條。對(duì)照組表達(dá)HLA易感基因DR*17-B位點(diǎn)單倍型16條。ESRD患者組比對(duì)照組多表達(dá)

20、的單倍型為B*13-DR*17,B*62-DR*17,B*39-DR*17,B*61-DR*17,B*48-DR*17,B*56-DR*17,B*07-DR*17,B*45-DR*17,B*76-DR*17,B*18-DR*17,B*77-DR*17,B*72-DR*17,B*78-DR*17,B*63-DR*17,B*42-DR*17。兩組對(duì)比,在ESRD患者組中未發(fā)現(xiàn)頻率顯著升高的單倍型。
　　 結(jié)論：
　　 1.H